食品界

耐斯糖通过BMP和Wnt/β-catenin通路减弱卵巢切除小鼠的骨质流失并促进BMSCs分化为成骨

Introduction

骨质疏松症（OP）是一种全身性代谢疾病，其特征在于骨量的减少和骨微结构的恶化，最终导致骨折风险增加。现有的各种医学疗法，如雌激素替代疗法以及双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂和钙制剂的使用等，具有较好的治疗效果，但这些合成药物可能会引起不良反应，限制了其临床应用。因此，开发和探索更有效、更安全的抗骨质疏松药物以造福更多患者，迫在眉睫。

骨重建包括成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收。破骨细胞活性过强或成骨细胞活性较弱会导致骨质流失，最终导致OP的发生。其中，成骨细胞骨形成减弱是关键因素。成骨细胞由骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化形成，在特定条件下还可能分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等多种功能细胞。控制BMSCs向成脂细胞或成骨细胞的分化是促进骨形成、预防和治疗OP的潜在策略之一。

BMSCs分化为成骨细胞的过程包括增殖、分化和骨基质矿化，受骨形态发生蛋白（BMP）和Wnt/β-catenin通路的调控。BMP2是BMP家族重要成员，与其跨膜受体结合激活Smad信号通路，直接调控BMSCs向成骨细胞或脂肪细胞的分化。Wnt家族由大量分泌的糖蛋白组成，参与干细胞的发育、代谢以及其他关键生物学过程。Wnt配体通过与跨膜卷曲受体（FZD）和LRP5/6共受体结合，以稳定β-catenin并降低其磷酸化。

寡糖是一种低聚合度的碳水化合物，由于其独特的异构体构型、糖苷键、单糖组成和相对分子量，具有不同的生化和生理特性。前期研究表明，从巴戟天（MO）中提取的低聚糖可以促进BMSCs向成骨细胞分化。耐斯糖（NST）是MO中低聚糖的主要成分，其对OP的治疗作用及其诱导BMSCs分化为成骨细胞的机制尚不清楚。基于此，推测NST可能通过BMP和Wnt/β-catenin途径促进BMSCs向成骨细胞分化，以预防骨质流失。本文研究目的在于通过动物实验验证NST的抗骨质疏松作用，并探讨NST诱导BMSCs向成骨细胞分化的潜在作用机制。

Results and discussion

NST的化学结构

分别采用¹H NMR光谱和HMBC光谱确定NST的糖苷键构型和主链结构。结果如图1所示，其糖基归属为A，α-D-Glcp（1→；B，→1）-β-D-Fruf-（2→；C，→1）-β-D-Fruf-（2→和D，β-D-Fruf-（2→）。此外，确定NST的结构为β-D-Fruf-（2→1）-β-D-Fruf-（2→1）-β-D-Fruf-（2→1）-α-D-Glcp，与文献中的结果一致。

图1 NST的结构鉴定

NST抑制OVX小鼠体重增加但不影响其子宫质量

卵巢切除（OVX）会引起雌激素缺乏，导致体重增加和子宫重量下降。如图2所示，实验开始时所有动物的体重没有显著差异。实验8周后，各组小鼠体重逐渐增加。实验结束时，与假手术对照组相比，卵巢切除组小鼠体重显著增加。这表明，NST可抑制卵巢切除引起的体重过度增加。同时，NST对其子宫重量无明显影响，表明NST对子宫增生无明显刺激作用。

图2 NST对OVX模型小鼠体重和子宫重量的影响

NST降低OVX小鼠尿钙和尿DPD水平

随着骨质流失和骨基质降解，小鼠尿钙和尿脱氧吡啶酚（DPD）显著升高。如图3所示，与假手术组相比，OVX组尿钙和尿DPD水平显著升高，E₂V治疗显著降低OVX小鼠尿钙和尿DPD水平。同样地，40、80、160 mg/kg剂量的NST降低了OVX小鼠尿DPD水平，80、160 mg/kg剂量的NST降低了OVX小鼠尿钙水平。

图3 NST对OVX模型小鼠尿液中（A）DPD和（B）Ca水平的影响

NST增加BMD并缓解OVX小鼠骨组织微结构的恶化

卵巢切除会导致骨密度（BMD）的下降和小鼠骨组织微结构的恶化。显微CT分析显示（图4A和4B），假手术组小鼠股骨微结构完整，骨小梁致密，而OVX组小鼠股骨微结构严重受损，骨小梁稀疏，其数量显著减少、间隙显著增大。E₂V和NST治疗可以逆转卵巢切除小鼠股骨微结构的改变，使其骨小梁数量增加、骨小梁间距缩小。此外，图4C-4H结果表明，NST治疗后小鼠BMD、BV/TV、Tb.N.和Tb.Th.均显著升高，BS/BV和Tb.Sp显著降低，证明NST对OVX小鼠的骨质流失具有抑制作用。

图4 NST对OVX模型小鼠骨组织微结构的影响

NST促进BMSC增殖及其向成骨细胞的分化

BMSCs具有分化为成骨细胞的潜力。成骨细胞产生某些特定蛋白质形成骨基质，并进一步矿化为骨结节。如图5所示，剂量为10^-10、10^-9、10^-8 mol/L的NST可显著促进BMSCs的增殖、提高ALP的活性，增强OPN和COL-I等骨基质蛋白的表达，促进骨矿结节的形成。这表明NST促进BMSCs分化为成骨细胞，并增强骨形成活性。

图5 NST对BMSCs成骨分化的影响

NST减少BMSCs向脂肪细胞的分化

骨质疏松症患者BMSCs分化为脂肪细胞的过程增强，最终导致成骨减少和骨质流失。对NST治疗7天后的成脂BMSCs进行油红O染色以验证NST对BMSCs脂肪形成的干预作用。结果如图6所示，剂量为10^-10、10^-9和10^-8 mol/L的NST治疗BMSCs显著降低细胞内脂质积累，抑制PPAR-γ和脂联素的表达。这表明NST会抑制BMSCs的脂肪细胞分化。

图6 NST对BMSCs成脂分化的影响

NST参与BMSCs中BMP信号通路的调控

在BMP信号通路参与调控BMSCs分化为成骨细胞的研究基础上，进一步探究了NST对BMP信号通路的调节作用。结果发现，NST处理BMSCs后，BMP2、Smad4和P-Smad1/5/8的表达显著增加，转录因子Runx2、Osterix和Dlx5的表达也显著增强（图7A和7B）。此外，BMP信号通路抑制剂Noggin可以消除NST对BMSC增殖和ALP活性的影响，抵消NST对BMP信号通路的调节作用（图7C和7D）。以上结果表明，NST通过BMP信号通路促进BMSCs向成骨细胞的分化。

图7 NST激活BMSCs中的BMP信号通路

NST参与BMSCs中的Wnt/β-catenin信号通路的调控

Wnt/β-catenin信号通路也是BMSCs向成骨细胞分化的重要调控机制。NST处理BMSCs后显著增加β-catenin的磷酸化以及LRP5和wnt3a的表达（图8A）。此外，Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂DKK-1可以消除NST对BMSCs增殖、ALP活性和Wnt/β-catenin信号通路激活的影响（图8B和8C）。以上结果表明，NST可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs向成骨细胞的分化。

图8 NST激活BMSCs中Wnt/β-catenin信号通路

NST对BMP2和β-catenin荧光素酶活性的影响及其分子对接研究

通过检测NST对BMP2和β-catenin荧光素酶活性的影响以证实上述结果，同时采用Schrödinger suite中的Glidedock模块对NST和β-catenin晶体结构进行分子对接分析。结果表明，NST剂量为10^-8 mol/L时可以显著增强BMP2的活性，剂量为10^-9和10^-8 mol/L时可以显著增强细胞中β-catenin荧光素酶的活性（图9A和9B）。NST的结合模式如图9C和图9D所示，NST整个分子位于β-catenin的活性中心。基于荧光素酶报告基因分析和分子对接的结果可以进一步解释NST对BMP和Wnt/β-catenin通路的调节作用。

图9 NST对BMP2和β-catenin荧光素酶活性的影响及其分子对接研究

Conclusion

MO寡糖具有抗骨质疏松、抗抑郁、抗老年痴呆等多种药理作用。NST是MO低聚糖的主要成分。本文研究表明，NST可以改善OVX小鼠骨组织微结构并减少骨质流失，通过调节BMP和Wnt/β-catenin信号通路诱导BMSCs分化为成骨细胞，同时，通过抑制PPAR-γ和脂联素的表达从而抑制BMSCs分化为脂肪细胞（图10）。综上所示，本文为NST作为骨形成促进剂治疗OP的潜在途径提供了新的见解。

图10 NST通过激活BMP和Wnt/β-catenin通路促进BMSCs分化为成骨细胞的示意图

Nystose attenuates bone loss and promotes BMSCs differentiation to osteoblasts through BMP and Wnt/β-catenin pathway in ovariectomized mice

Qi Zhang^a, Sijing Hu^a, Jianjun Wu^a, Peng Sun^a, Quanlong Zhang^a, Yang Wang^b, Qiming Zhao^a, Ting Han^c,*, Luping Qin^a,c,*, Qiaoyan Zhang^a,c,*

^aSchool of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

^bZhejiang Traditional Chinese Medicine & Health Industry Group Co., Ltd. Hangzhou 310016, China

^cSchool of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

*Corresponding author.

Abstract

Increasing the osteogenic differentiation ability and decreasing the adipogenic differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is a potential strategy for the treatment of osteoporosis (OP). Naturally derived oligosaccharides have shown significant anti-osteoporotic effects. Nystose (NST), an oligosaccharide, was isolated from the roots of Morinda officinalis How. (MO). The aim of the present study was to investigate the effects of NST on bone loss in ovariectomized mice, and explore the underlying mechanism of NST in promoting differentiation of BMSCs to osteoblasts. Administration of NST (40, 80 and 160 mg/kg) and the positive control of estradiol valerate (0.2 mg/kg) for 8 weeks significantly prevented bone loss induced by ovariectomy (OVX), increased the bone mass density (BMD), improved the bone microarchitecture and reduced urine calcium and deoxypyridinoline (DPD) in ovariectomized mice, while inhibited the increase of body weight without significantly affecting the uterus weight. Furthermore, we found that NST increased osteogenic differentiation, inhibited adipogenic differentiation of BMSCs in vitro, and upregulated the expression of the key proteins of BMP and Wnt/β-catenin pathways. In addition, Noggin and Dickkopf-related protein-1 (DKK-1) reversed the effect of NST on osteogenic differentiation and expression of the key proteins in BMP and Wnt/β-catenin pathway. The luciferase activities and the molecular docking analysis further supported the mechanism of NST. In conclusion, these results indicating that NST can be clinically used as a potential alternative medicine for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis.

Reference:

ZHANG Q, HU S J, WU J J, et al. Nystose attenuates bone loss and promotes BMSCs differentiation to osteoblasts through BMP and Wnt/β-catenin pathway in ovariectomized mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2): 634-646. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.066.