杜仲（Eucommia ulmoides）是我国特有的单科单属单种木本植物，包含多种生物活性化学物质，如环烯醚萜、酚类、甾体、萜类和类黄酮等，杜仲叶是这些生物活性物质富集的主要部位，具有多种生物活性功效，如抗肥胖、抗氧化、糖基化抑制、抗高血压、抗骨质疏松、改善酒精性脂肪肝、改善阿尔兹海默症以及抗衰老等，2018年杜仲叶被纳入药食同源名单。

1 .不同发酵时间杜仲金花代谢物PCA

0 d组对2 d组、0 d组对4 d组、0 d组对6 d组、0 d组对8 d组、0 d组对10 d组OPLS-DA模型得分散点图如图2所示。图2中OPLS-DA得分图的横坐标t_p[1]表示在第1象限中主要成分得分值，展示样本组间差异，纵坐标t_o[1]表示在第1象限中正交PC得分值，展示样本组内差异，每个散点代表一个样本，散点形状和颜色表示不同的实验分组，样本间横向距离越远表明组间差异越大，纵向距离越近表明组内重复性越好。由图2可以看出，每两组样本的区分非常显著，样本全部处于95%置信区间内，表明杜仲金花茶发酵过程中的代谢物存在显著差异，可用于后续差异成分分析。

3.杜仲茶发酵前后的差异代谢物筛选及分析

以VIP＞1且P＜0.05为标准对杜仲金花茶发酵过程中的样品进行比较，共检测出显著差异代谢物13类172 种。主要有黄酮类化合物、脂肪酸类化合物、氨基酸、有机酸、糖类及其衍生物、芳香类化合物、苯丙素类、香豆素类、木脂素类、生物碱、醇类、植物激素13个类别（表1）。根据OPLS-DA，以FC＞2或FC＜0.5，P＜0.05为标准，对发酵前后显著差异代谢物进行筛选，其中显著上调的代谢物有107 种，显著下调的代谢物有65 种，且黄酮类化合物、脂肪酸类化合物差异显著代谢物占比最高。

茶独特的健康功效与其丰富的功能性内含物质茶多酚、茶褐素、黄酮类、茶多糖等息息相关。发酵后的杜仲茶黄酮类化合物（26.74%）和脂肪酸类化合物（25.58%）的差异代谢物占据一半以上，它们是香气、滋味物质形成的重要前体物质，是杜仲茶滋味醇厚形成的重要原因。

4.杜仲茶发酵过程中代谢物差异丰度分析

在杜仲茶发酵第2天，脂肪代谢中鞘脂代谢、甘油磷脂、亚油酸代谢已经开始增加，蛋白代谢中的氨基酸却没有变化。可以推断接菌后，杜仲茶发酵前期以脂肪代谢为主。发酵到第4天，VB6开始降解，泛酸和辅酶A的生物合成和碳水化合物代谢开始显著增加。发酵到第6天，生物代谢开始大幅度降低，主要包括氨基酸代谢中的半胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸丰度降低，以及第2信使中内酰胺生物合成降低。脂质代谢中花生四烯酸代谢和亚油酸丰度降低，意味着杜仲茶风味物质的增加。发酵过程进行到第8天，VB6和VB2代谢开始增加。发酵第10天，戊糖、葡萄糖醛酸转换代谢、抗坏血酸和醛酸代谢丰度增加，半乳糖代谢降低。

5.差异代谢物变化趋势分析

杜仲金花茶中嘌呤代谢通路中代谢物含量随发酵时间的变化趋势如图4所示。该通路中富集9 种化合物，其中腺嘌呤、鸟嘌呤和环磷腺苷3 种物质在杜仲金花茶中的含量随发酵时间的变化趋势相同，都呈现出先升高（2 d和4 d）再降低（6 d和8 d）后回升（10 d）的趋势。腺苷酸、鸟苷酸、环鸟苷酸和单磷酸腺苷呈现先升高再下降后保持平稳的趋势。次黄嘌呤和5-羟基异硫酸含量在整个发酵过程中呈现整体升高的趋势。发酵后茶叶中富含嘌呤生物碱，会造成茶叶滋味苦涩，具有利尿、兴奋神经中枢等功能。

杜仲金花茶中花生四烯酸代谢通路中代谢物含量随发酵时间的变化趋势如图6所示。该通路中7 种代谢物含量的变化规律差异很大。5,6-二羟基三烯酸和11(R)-羟基二十碳四烯酸含量随着发酵时间的延长而显著降低，发酵末期时显著低于未发酵和发酵初期的含量，说明在发酵过程中被不断消耗。与此相反的是，20-羟二十碳四烯酸属于长链脂肪酸，含量呈现整体升高的趋势，发酵末期时的含量显著高于未发酵和发酵初期的含量。20-羟二十碳四烯酸是花生四烯酸的主要生物活性代谢物，由细胞色素P450（CYP）4A酶合成，可降血压抑制血管炎症的发生。白三烯F4、前列腺素I2和前列腺素B2含量在发酵过程中波动较大。而磷脂酰胆碱（24∶1(15Z)/22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)）含量在整个发酵过程中变化不明显，趋于平缓。

杜仲金花茶中戊糖和葡萄糖醛酸相互转换通路中的代谢物含量在发酵过程中的变化如图7所示。该通路中的5 种物质在发酵过程中都呈现出整体升高的趋势，在发酵末期含量显著高于未发酵和发酵初期。尤其是辛酰葡萄糖醛酸，在未发酵的金花茶和发酵初期含量近乎为零，到发酵中期含量迅速升高。葡萄糖醛酸在肝脏中可与多种有害物质结合，发挥解毒作用。杜仲茶发酵中后期葡萄糖醛酸含量的提高，进一步增加了杜仲茶的保健功效。

诺缬氨酸是人体的一种必需氨基酸，在杜仲金花茶中含量相对较低，但是经过发酵后，其含量显著升高，说明发酵过程促进了这些物质的生成。与此相同变化趋势的物质还有豆甾烷-3,6-二酮等。金丝桃苷在杜仲金花茶中含量也相对较高，在发酵过程中，其含量随着发酵时间的延长而进一步增加。

杜仲金花茶在发酵过程中产生了13类172 种显著差异代谢产物，最佳发酵时间为6～8 d。发酵各时期中的差异代谢物含量显著提高的生物活性物质包括黄酮类、脂肪酸类能占据总代谢物一半以上，黄酮和黄酮醇的生物合成、氨基酸的生物合成和脂类代谢物为提升杜仲茶的滋味和香气起到重要作用。代谢物L-谷氨酰胺、20-羟二十碳四烯酸、葡萄糖醛酸、反式阿魏酸、诺缬氨酸和金丝桃苷，赋予了发酵杜仲茶抗氧化、降血压、解毒、抗炎、提高免疫力等保健功效。