黑龙江大学生命科学学院的靳宏宇（第一作者）和孙庆申教授（通信作者）等在前期研究中，已分离出植物乳杆菌L3（GenBank登录号：MT781360），其可以分泌具有广谱抗菌活性的细菌素L3。本研究研究细菌素L3的抗菌机制，并通过全基因组分析预测L. plantarum L3菌株的功能，旨在为该菌株在食品工业中的应用提供理论依据，特别是其在乳制品中的潜在应用。

选择8 种常用的抗生素来评估L. plantarum L3的MIC。如表1所示，L. plantarum L3对8 种抗生素表现出不同的敏感性，对利福平和链霉素有较强的敏感性，但对环丙沙星和氯霉素不敏感，说明该菌株具有良好的安全性。

溶血是评价乳酸菌安全性的重要指标之一。溶血实验结果如图1所示。以单核增生李斯特菌为对照，发现L. plantarum L3菌落周围既无草绿色环，也无透明环，属于无毒的γ-溶血，说明该菌株不存在引起败血症的隐患，安全性好。

图2显示，对照组的OD_{260 nm}没有随着培养时间的增加而显著波动，说明对照组的细胞含量没有泄漏。在3 株菌株中，细菌素L3的2×MIC导OD_260nm显著增加，说明细菌素L3可能导致指示菌细胞中的核酸流出。

接种后6~12 h内定金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和酵母菌培养基电导率，结果见图3。在所有3 个指示菌株中，与对照组相比，用细菌素L3（2×MIC）处理的肉汤的总电导率明显增加（P<0.05）。电导率的快速增加显示3 种指示菌细胞的不同趋势，这可能与微生物细胞的不同生长速度有关。

细胞膜的破坏往往伴随着细胞内容物的渗漏，如核酸、K⁺和其他物质。因此，本研究通过检测细菌素处理后不同时间内指示菌的OD_{260 nm}评价细胞膜的通透性，并通过电导率分析验证其对细胞膜通透性和完整性的影响。结果表明，细菌素L3可以破坏细胞膜，并排泄出细胞内容物，从而导致细胞死亡。

通过对reads进行长度及数据量累计进行统计绘图如图4a，用Circos v0.66 软件绘制基因组圆图，结果见图4b。如图4b和表 2所示，L. plantarum L3 的基因组大小为3 187 020 bp，GC 含量为44.57%，共注释了3 024个编码基因，序列长度为2 679 162 bp，占基因组总长度的 84.06%。该基因组仅含有0.13%的重复序列，通过以下方法进行分析 RepeatMasker v4.0.5 软件分析。在全基因组中，发现了137 个非编码 RNA（ncRNA）基因，包括16 个rRNA，76 个 tRNA和 41 个其他 ncRNA。

图5A显示使用GO数据库分析的L. plantarum L3的潜在功能。总共有3 024个基因进行了功能注释。L. plantarum L3在催化活性、结合活性以及代谢和细胞过程方面显示出优势。在分子功能中，基因数量最多的注释功能是催化作用，其次是结合和运输。与细胞成分有关的基因被注释在细胞、细胞成分和细胞器中。在生物过程乃至整个GO注释结果中，被注释的基因数量最多的是新陈代谢。细胞成分注释的结果显示，L. plantarum L3具有很强的生物膜形成能力，生物膜可以保护细菌免受外界环境的影响。

图5B显示使用KEGG的注释信息。L. plantarum L3的基因功能可分为三类，即遗传信息处理、环境信息处理和代谢，分别涉及180、197 个和912 个基因。总共获得了1 289 条注释信息，这些被注释的基因参与了各种代谢途径。在所有的KEGG途径中，氨基酸的生物合成占107 条途径，其次是ATP结合盒（ABC）转运器，碳代谢也涉及74 条途径。还有LIVCS阳离子转运体家族和细菌/淀粉转运体家族的多个成员，表明L. plantarum L3具有较强的繁殖能力，旺盛的生理代谢和较强的细胞膜通透性。这些结果与GO功能注释的结果是一致的。例如，UDP-N-乙酰壁氨酰三肽与赖氨酸的合成有关。这些结果表明，在L. plantarum L3的培养过程中，可以产生更多种类和数量的蛋白质。

通过使用eggNOG数据库进行比较注释（图5C），得到了2485个注释蛋白，其中一般功能预测所占比例最大（10.3%），其次是碳水化合物运输和代谢（9.87%）、转录（8.68%）、氨基酸运输和代谢（7.66%）。L. plantarum L3在与碳水化合物运输和代谢以及转录有关的功能中显示出最高的丰度。

如图5D所示，L. plantarum L3含有编码各种碳水化合物降解酶的基因，用CAZy数据库分析，其中糖苷水解酶（GHs）和糖基转移酶（GTs）分别占37.09%和27.41%。L. plantarum L3还含有少量的多糖裂解酶（PLs），从而保持了L. plantarum L3的催化活性。

图5E和表3 显示了使用TCDB数据库的注释结果。参与电化学电位驱动的转运蛋白，主动转运蛋白所占的比例最大，ABC转运蛋白是其中主要的运输蛋白之一。同时也存在MFS转运蛋白家族。这些结果与KEGG分析的结果一致，表明L. plantarum L3的运输功能主要取决于主动运输和离子泵的相互作用。

如图6 所示，在 L. plantarum L3 基因组中有两个潜在的热点。这两个核心蛋白都属于IIb类细菌素，分别为Plantaricin E和Plantaricin F肽之间的相互作用使细菌素具有高的抗菌活性。产生IIb类细菌素需要不同的基因，包括编码细菌素前体的结构基因、编码ABC转运器中免疫蛋白的基因，以及编码排列在一个或多个操作子中的副蛋白的基因，这些基因可能参与细菌素的免疫和转运。L. plantarum L3具有相对完整的调节基因。一个操作子包含细菌素前体结构基因plnEF-编码细菌素前体肽，plnG-编码ABC转运体，plnI-编码免疫蛋白，可以保证对有害细菌的拮抗作用，保护自身不受细菌素L3的抑制。Ⅱb类细菌素中GxxxG的保守序列使两个多肽形成膜渗透性的螺旋-螺旋结构，然后与靶细胞膜上的识别蛋白结合，使其发生构象变化，形成复杂而特异的孔隙，这也与上述抗菌机制的结果一致。

如表4和图7所示，Plantaricin E和Plantaricin F不包含预测的跨膜区，而且跨膜螺旋的氨基酸残基数小于1，说明L. plantarum L3产生的细菌素没有相关的跨膜结构，细菌素是在其他转运蛋白的帮助下运输到细胞基质之外的。plnG跨膜螺旋的氨基酸残基数为112.816 2，有5 个预测的跨膜区域。plnG在细菌素的转运中发挥了重要作用，L. plantarum L3产生的细菌素L3被转运出细胞，对有害细菌起到了拮抗作用。plnG的具体机制还需要进一步研究。

用 SOPMA 分析L. plantarum L3细菌素相关基因的编码产物的二级结构，如表4所示。结果显示，Plantaricin E和Plantaricin F的结构相似，以α-螺旋为主要结构，其次是无规则卷曲。

在Plantaricin E中，α-螺旋和β-转角的相对含量为78.58%，明显高于Plantaricin F。二级结构中α-螺旋和β-转角的相对含量较高，保证了蛋白质的高稳定性。因此，可以推断出Plantaricin E比Plantaricin F具有更好的稳定性。

孙庆申 教授

黑龙江大学生命科学学院

孙庆申，男（1977—），黑龙江大学教授，硕士生导师，第十二届黑龙江省青年科技奖获得者，黑龙江省科协优秀青年科技人才，黑龙江省食品科学技术学会及黑龙江省轻工业协会常务理事，黑龙江省人民政府食品安全专家委员会专家，黑龙江省服务中小微企业、助力“百千万”工程专家学者(高技能人才)库成员，《食品工业科技》杂志青年编委，《乳业科学与技术》杂志编委。工作以来，孙庆申主持了国家青年科学基金项目、黑龙江省科技厅面上项目，黑龙江大学杰出青年基金项目、黑龙江省教育厅面上项目、黑龙江省科技攻关项目二级课题、黑龙江省博士后基金项目、黑龙江大学青年基金项目、黑龙江大学博士启动基金项目，同时参与了黑龙江省青年基金，黑龙江省教育厅指导项目的研究。培养硕士研究生40余名。公开发表论文70余篇,其中SCI收录论文15 篇，出版专著一部，授权国家技术发明专利6 项，获黑龙江省青年科技奖等各类奖项8 项。

第一作者介绍

靳宏宇 硕士研究生

黑龙江大学生命科学学院

靳宏宇，男（1995—），硕士研究生，黑龙江大学生命科学学院，从事食品和药物生物活性挖掘及研发研究。