食品界

安徽省食品药品检验研究院张居舟高级工程师等：全自动固相萃取结合UPLC-MS/MS同时测定蜂蜜

蜂蜜是一种营养价值较高、药食同源的天然物质，其主要成分是糖类和水分，以及少量的微量元素、氨基酸、酶类、有机酸、酚酸和黄酮类等生物活性物质。酚酸、黄酮类物质是很好的内源性标记物，针对此类化合物，建立一种准确、高效的内源性成分检测方法对鉴别蜂蜜种类和蜜源地有重要的意义与价值。

安徽省食品药品检验研究院的李静、张居舟等采用HLB小柱在线固相萃取，首次使用磷酸盐缓冲液提取和Eclipse Plus RRHD C18色谱柱分离，并结合动态多反应监测模式（dMRM），通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定蜂蜜中26 种脱落酸、酚酸和黄酮等内源性组分，研究荆条蜜、洋槐蜜和油菜蜜中各内源性组分的含量差别，该方法可为市场监管部门对蜂蜜品质控制和成分检测提供技术支持。

结果与分析

1 质谱条件的优化

酚酸和黄酮类化合物结构富含羟基，正、负离子扫描方式下各待测化合物均有较高的响应强度，但正离子模式下碎片离子数多，不稳定，因此本实验选择ESI^－，对各母离子进行全扫描，其中表儿茶素和儿茶素、对羟基苯甲酸和水杨酸、片素和山柰酚、芹菜素和染料木素4 对化合物互为同分异构体，需使用各单标溶液优化碎片离子及碰撞能量。根据欧盟2002/657/EC指令的要求，每种化合物至少选择2 对特征碎片离子进行定量和定性，形成MRM方法后，在优化好的色谱条件下，进样采集数据，在已采集的数据基础上自动升级为dMRM质谱方法，每个化合物的驻留时间自动进行最优分配，峰响应强度均有不同程度的提升。优化后质谱参数见表2。

2 UPLC条件的优化

色谱柱的优化

本研究比较Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱的分离情况。对于RRHD C18色谱柱，除了对没食子酸分离的峰形不如在HSS T3上的对称性更好，及对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸、表儿茶素4 种化合物的响应强度稍高以外，其他21 种化合物的响应强度更高（如绿原酸、儿茶素、芦丁、p-香豆酸、水杨酸、脱落酸、片素、槲皮素、芹菜素、柚皮素、山柰酚、汉黄芩素、白杨素、生松素、高良姜素）或相当（如原儿茶酸、丁香酸、芥子酸、杨梅酮、桑黄素、染料木素），且峰形更好，表儿茶素和儿茶素等4 对同分异构体也得到有效分离；而BEH HILIC色谱柱的分离效果和待测化合物的响应强度均稍逊于RRHD C18和HSS T3。综合考虑，选择对大多数化合物分离效果更好的RRHD C18色谱柱。各待测化合物的dMRM图如图1所示。

流动相的优化

实验考察水-乙腈、甲酸溶液-乙腈、甲酸溶液-甲醇体系的色谱分离效果，由于甲酸在水溶液中电离出正离子后，易与酚酸或黄酮类化合物的氧负离子重新结合成分子，影响离子响应强度，故甲酸溶液-乙腈和甲酸溶液-甲醇体系下的各组分响应强度均较高，但甲酸溶液-乙腈体系的峰形更好。实验进一步研究不同甲酸溶液的影响，从通用的0.1%甲酸溶液开始，依次比较0.08%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%甲酸溶液各被测组分的峰高或响应强度，随着甲酸体积分数的降低，各峰响应强度依次增强，如图2所示，当0.03%甲酸溶液-乙腈梯度洗脱程序时，峰响应强度达到最高，0.02%以下绿原酸和杨梅酮呈下降趋势，除柚皮素、丁香酸、阿魏酸稍有增加外，其余化合物均无明显差别。由于杨梅酮的灵敏度低，最终选择杨梅酮响应最高的0.03%甲酸溶液-乙腈体系。

3 提取溶剂的选择

鉴于待测化合物多为弱有机酸，在pH 7水溶液中易发生电离，因此，实验比较pH 3磷酸盐缓冲溶液和pH 2盐酸溶液，除了原儿茶酸在磷酸盐缓冲液中的回收率114%，在pH 2盐酸中为160%外，其他25种待测化合物的提取回收率为92%～118%，且在两种提取溶剂里的差别不明显。本实验选择pH 3磷酸盐缓冲溶液作为提取液。

4 净化条件的优化

根据待测化合物及提取液的性质，实验比较 MAX（60 mg/3 mL）、C18（500 mg/6 mL）及不同规格的HLB（500、200、60 mg）小柱的净化效果。MAX使用2%甲酸-甲醇洗脱，C18、HLB依次分别实验5%氨水-甲醇和甲醇作为洗脱剂，选择在MAX、C18和HLB小柱上最优的净化效果数据进行比较。由图3可知，丁香酸、芦丁、p-香豆酸、芥子酸、脱落酸、柚皮素和生松素在不同净化小柱上的回收率均接近100%。对于HLB/200 mg小柱，杨梅酮、桑黄素、槲皮素的回收率低于60%，没食子酸高于120%；对于HLB/500 mg小柱，杨梅酮的回收率不到10%；对于MAX小柱，没食子酸等8 种化合物的回收率低于70%；对于C18小柱，没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸的回收率不足60%。这与文献中C18与HLB净化效果差异不大的结论存在差异，可能是由于上样液及净化过程不同。实验最终选择回收率（92%～115%）均较好的HLB/60 mg小柱，且选择甲醇作为洗脱溶剂。

5 方法学考察结果

线性范围和灵敏度

由于蜂蜜基质中均不同程度地含有待测组分，故实验选择空白糖浆基质模拟蜂蜜基质加标，进行方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）实验，在优化后的实验条件下，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，绘制校准曲线，如表3所示，各化合物在各自的线性范围内，线性相关系数r2大于0.996，并分别以信噪比大于3和10确定方法的LOD和LOQ。

添加回收率和精密度实验结果

以洋槐蜜为例，待测化合物的灵敏度存在差异，在蜂蜜中的本底含量也不同，且部分待测化合物含量较高，在定量限水平加标时，误差较大，故加标水平着重考察线性范围的中、上加标量的10 倍LOQ、20 倍LOQ、50 倍LOQ，选择待测组分含量相对较少的洋槐蜜作为样品基质进行加标实验，平行测定6 次，见表3，方法的平均回收率为81.9%～101%，相对标准偏差（RSD）为3.4%～9.8%，可以满足蜂蜜中各待测组分含量测定的需要。

6 实际样品检测结果

利用该方法对荆条蜜、油菜蜜、洋槐蜜、麦芽糖浆、果糖糖浆、淀粉糖浆分别进行检测，发现不同蜜蜂中的待测组分含量比例存在一定的差异，基于实验样品的数量（3 种天然成熟蜂蜜各12 批次，3 种市售蜂蜜各24 批次），3 种天然成熟蜂蜜中各取一个样品的检测结果见表4。荆条蜜中含量较高的依次是没食子酸、槲皮素、对羟基苯甲酸、绿原酸和山柰酚等，未检出桑黄素和汉黄芩素，且有的荆条蜜也未检出杨梅酮和染料木素。油菜蜜中含量较高的依次是槲皮素、没食子酸、山柰酚、对羟基苯甲酸和水杨酸等，未检出桑黄素和汉黄芩素，且杨梅酮的含量低于定量限。洋槐蜜中含量较高的依次是没食子酸、脱落酸、对羟基苯甲酸、水杨酸和生松素等，未检出杨梅酮、汉黄芩素和桑黄素，且有的洋槐蜜也未检出表儿茶素、芥子酸和染料木素。

市售蜂蜜植物源属性未知，按标称的蜜源分析，各待测物的含量差异与天然成熟蜂蜜相比不完全一致，故还需进一步进行辨别分析。对于假蜂蜜的可能原料果糖糖浆检出没食子酸、儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸，含量均不及天然成熟蜂蜜（荆条蜜）的1/6；淀粉糖浆和麦芽糖浆均检出没食子酸、原儿茶酸及微量的丁香酸；其他待测组分均为未检出。

结论

将dMRM模式与全自动固相萃取的优势相结合，优化提取、净化和色谱分离条件，建立了蜂蜜中脱落酸、原儿茶酸、表儿茶素等26 种内源性组分的检测方法。较目前文献方法增加了8 种可同时分析的组分，且灵敏度提高了约8 倍。本方法选择性好、准确度高，前处理操作简捷，适合快速、高通量分析蜂蜜中的酚酸和黄酮类组分。定量结果表明，不同蜜源的蜂蜜样品中内源性组分含量及含量比例存在显著差异，这为进一步研究蜂蜜种类鉴别模型及验证模型提供了方向，也为蜂蜜品质控制及溯源鉴别技术提供了支持。

本文《全自动固相萃取结合UPLC-MS/MS同时测定蜂蜜中26 种内源性组分》来源于《食品科学》2023年44卷10期265-272页，作者：李静，张居舟，刘毅，余晓娟，王欣。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220501-006。