双孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇，是世界上种植和消费最广泛的食用菌，占每年食用菌总量的10%。双孢蘑菇不仅味道鲜美，而且具有丰富的营养和药用价值。蘑菇采后褐变是一个复杂的化学过程，其中酶促褐变主要归因于多酚氧化酶（PPO）的作用。PPO有膜结合态（mPPO）和可溶态（sPPO）两种存在形式，二者在分离纯化和酶活力等方面不一致。PPO的合成和运输是一个复杂的过程，mPPO的高活力对果蔬在成熟和衰老过程发生酶促褐变的程度可能具有较大影响。

天津商业大学生物技术与食品科学学院的何兴兴，关文强*和陕西宏梁食品科技有限公司的雷静通过粗酶提取、不同饱和度硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换柱层析对双孢蘑菇的sPPO和mPPO进行初步分离纯化和基本酶学性质的研究，旨在开发一种双孢蘑菇两种不同形态PPO的提取纯化方法，为其他真菌类蔬菜PPO分离纯化提供一定的方法借鉴，也为开发抑制双孢蘑菇酶促褐变的技术提供理论基础。

以牛血清蛋白作为标准物进行标准曲线制作。由该曲线线性拟合求得线性回归方程为Y=5.867 1X＋0.000 5，R²=0.999 1。说明本曲线在蛋白质量浓度0.0～1.0 mg/mL范围内有良好的线性关系。

如图2所示，在进行sPPO和mPPO柱层析时，使用0～0.5 mol/L的NaCl洗脱液进行洗脱过程中，每个洗脱梯度均出现不同程度的蛋白峰，且蛋白峰的高度随NaCl浓度的增加逐渐减小，当NaCl浓度为0 mol/L洗脱时，sPPO和mPPO粗酶液中洗脱下来的蛋白吸收峰均最大，但相应的酶活力都很小，说明不含NaCl的洗脱液能将sPPO和mPPO蛋白溶液中的杂蛋白物质洗脱下来。当NaCl浓度增加至0.3 mol/L（30～40 管）时，sPPO和mPPO均出现最高酶活峰，分别为1 368 U/（mL·min）和576 U/（mL·min），且sPPO在31～35 管酶活最高，mPPO在31～33 管酶活力最高。而当NaCl浓度大于0.3 mol/L时，sPPO和mPPO洗脱下来的蛋白溶液所对应的酶活力均较低，说明此时所洗脱下来的蛋白质溶液均为杂蛋白。因此，将最高酶活力管进行合并，超滤浓缩后封存于20%甘油中于－30 ℃保存备用。

双孢蘑菇中的sPPO和mPPO在经硫酸铵沉淀、DEAESepharose Fast Flow柱层析分离纯化后其目标酶的回收率和纯化倍数如表3所示。双孢蘑菇sPPO和mPPO经逐步纯化后，总蛋白均明显下降，比活力明显提高。其中，sPPO经纯化后的最终目标蛋白质量为2.64 mg/mL，相比于粗蛋白溶液，酶比活力提高到12.20 倍，最终的酶比活力为6 912.88 U/mg。而mPPO在经50%～80%硫酸铵沉淀后，去除了41.34%杂蛋白，酶比活力提高到1.33 倍，经DEAE阴离子交换柱纯化后，酶比活力提高到19 092.94 U/mg，远高于sPPO的比活力，而相比于mPPO粗蛋白溶液，酶的比活力提高到10.86 倍，且纯化后的mPPO比活力高于蛇果（比活力为15.16 U/mg）、茄子（4 925 U/mg）、枇杷（91.5 U/mg）等。

sPPO和mPPO对底物邻苯二酚的酶促动力学曲线结果如图4所示，从拟合的Michaelis-Menten函数得出，sPPO的Km为8.85 mmol/L，Vmax为1 196 U/（mL·min），mPPO的Km为5.07 mmol/L，Vmax为3 120 U/（mL·min）。由此可知，mPPO跟邻苯二酚结合能力更强，褐变反应速度更快。这些结果说明PPO与某一底物间的亲和力与催化活性可能与酶源及同工酶构成有关。

从图5可以看出，sPPO和mPPO比活力先随温度升高而上升，均在30 ℃时达到最大值，然后随温度的继续升高而下降，表明sPPO和mPPO的最适反应温度均为30 ℃，该结果与大多数植物PPO的最适温度一致。此外，在低于20 ℃，高于45 ℃时，PPO活力较小。当反应温度升高到70 ℃时，sPPO和mPPO均不表现出明显活力。这是由于PPO在最适温度才能被完全激活，低温处理会抑制酶活力，但不致使其失去活力，而高温使蛋白变性而使酶失活。因此，在双孢蘑菇的酶促褐变控制方面通常采用低温贮藏抑制PPO的活力，从而延缓双孢蘑菇的褐变。

如图6所示，sPPO和mPPO在pH 3.0～8.0之间活力均呈现先上升后下降的变化趋势，最适pH值均为6.8。在小于pH 4.0或大于pH 7.5时，PPO的催化活性显著下降。这是因为PPO含辅助因子Cu2＋，Cu2＋在强酸性环境中会被解离出来，使酶失活。而在强碱条件下，Cu2＋会与溶液中OH·反应生成Cu(OH)2，也会造成酶失活。因此，通过调节pH值可有效抑制双孢蘑菇PPO的活力。该结果与已报道的双孢蘑菇的PPO最适pH值相近。

从表4可以看出，sPPO和mPPO对含不同羟基个数的多酚底物的催化活性差异很大，且sPPO和mPPO均对邻苯二酚的催化活性最高。实际上，果蔬的褐变程度与总酚含量关系更为密切而非取决于某种单一的多酚含量。不同的酶具有不同的最适底物。刘芳调研发现不同来源、不同种类植物果实的PPO最适底物差异较大，而同一种类植物果实在不同的生长发育阶段，其PPO最适底物也存在差异，且PPO不一定与其最适天然底物存在于同一植物体中。