食品界

东北农业大学孟祥晨教授：ETEC K88噬菌体PE-1的表征及体外生物防控活性评价

东北农业大学食品学院孟祥晨教授课题组从患有下痢的病死仔猪及其生活环境的样本中，分离得到一株能够有效控制目标病原菌的噬菌体PE-1，以ETEC K88作为抑制目标，对噬菌体PE-1的生长特性和体外抗菌效果进行了表征。

Introduction

肠产毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是导致断奶仔猪下痢的主要病原体，该类病原菌表面携带有一种名为黏附素的毒力因子，当菌体进入感染目标的消化道后，通过黏附素的作用使菌体附着于目标的肠上皮细胞表面，随即分泌一种或多种肠毒素，刺激肠细胞内的水分和离子流失，进而引起感染性腹泻，使感染机体快速脱水，甚至死亡。通常按照 ETEC 携带的黏附素对其进行分类，其中以 ETEC K88 的流行程度最为广泛。该类病原菌引发的仔猪感染性下痢疾病具有很强的传染性和较高的死亡率，对全球生猪养殖行业造成了严重损害。由于抗生素在生猪养殖行业的禁用，寻找一种能有效治疗ETEC感染的方法迫在眉睫。在这一背景下，课题组将注意力转向一种与细菌长期共同进化的独特病毒——噬菌体。噬菌体是能够特异性感染细菌细胞的病毒，它们分布广泛，且对靶细胞具有强大的杀伤效应。根据噬菌体入侵细胞的活动方式，通常将其划分为裂解性噬菌体和溶原性噬菌体两类。其中，裂解性噬菌体能够特异性地感染宿主菌细胞，并在利用宿主菌代谢系统增殖自身个体的同时将其杀灭。已有研究证实噬菌体是解决耐药菌和食源性病原菌污染的有效方法之一。因此，裂解性噬菌体可以被视为解决ETEC K88病原菌感染的一种新方法。

Results and discussion

噬菌体PE-1的形态学分析

首先对噬菌体PE-1进行形态学表征，观察噬菌体PE-1在透射电子显微镜下的形态。噬菌体PE-1的头部为多面体，长径约82 nm，短径约78 nm，轴比约为1。PE-1有一个相对较短的尾部，长度约为18 nm，宽度约为9 nm。噬菌体PE-1的总长度约为96~100 nm。电镜下尾部亮度较低，未观察到可伸缩的尾鞘或尾丝结构（图1A）。噬菌体-宿主细菌混合物的透射电子显微镜观察表明，细菌外膜表现出多个裂缝（图1B）。在细菌细胞的中部和边缘观察到数十个多面体颗粒，推测是感染该细菌的噬菌体PE-1代谢产生的子代噬菌体。

（A）噬菌体PE-1颗粒；（B）ETEC K88被噬菌体PE-1破坏。

图1 透射电子显微镜下噬菌体PE-1的形态

噬菌体PE-1的生长特性与环境耐受性

根据一步生长曲线测定结果，PE-1感染宿主细菌的潜伏期约为10 min（图2A），爆发期持续约20 min，根据感染结束时噬菌体滴度与感染开始时宿主细菌浓度的比率，计算出噬菌体PE-1的裂解量约为13。噬菌体PE-1还具有理想的温度和pH耐受性，在不高于65 ℃温度环境和3~11的pH环境下，噬菌体PE-1均能保有较高的滴度，这确保它可以在不同的应用环境中靶向宿主细菌。

图2 噬菌体PE-1的生物学特性。（A）噬菌体 PE-1 的一步生长曲线；（B）PE-1噬菌体的热稳定性；（C）噬菌体PE-1的pH稳定性。

噬菌体PE-1对增殖期宿主菌的抑制作用

在最佳感染复数条件下，宿主细菌浓度在1 h内没有显著增加，并保持在4.78 （lg（CFU/mL））（图3），在1~4 h内，宿主细菌浓度先下降到4.66（lg（CFU/mL）），随后缓慢恢复到初始浓度。观察3 h后，试验组与对照组的宿主菌浓度相差超过1.50 （lg（CFU/mL））。在4~6 h的观察间隔内，宿主细菌恢复了增殖率。整体来看，噬菌体PE-1将宿主细菌的增殖活动延迟了约4 h，且能够对宿主细菌群体产生快速抑制反应，并对宿主细菌的初始增殖形成阻碍。

图3 噬菌体PE-1对宿主细菌培养物对数生长期的影响

噬菌体PE-1对稳定期宿主菌的抑制作用

按不同感染复数将噬菌体PE-1添加到稳定期ETEC K88悬液中作为抗菌剂，与抗生素处理组进行对照试验。感染复数为10的噬菌体处理组效果较好（图4），使ETEC K88的浓度从8.00 （lg（CFU/mL））降至5.12（lg（CFU/mL）），抑菌效果仅次于诺氟沙星处理组（4.39 （lg（CFU/mL）））；整体来看，当滴度足够时，噬菌体PE-1的抑菌效率能达到与抗生素相仿的水准，作为一种通过裂解和增殖产生宿主杀伤作用的抑菌剂，噬菌体的性能与抗生素截然不同，噬菌体在完成裂解循环并从宿主中释放后，会持续存在于环境中，这种特性使噬菌体具有更长效的抗菌作用。

图4 宿主菌在不同条件下孵育4 h的浓度变化

Conclusion

这项研究从病原菌传播环境中分离并表征了一株ETEC K88病原菌靶向噬菌体PE-1，这种噬菌体裂解周期短，反应速度快，能有效降低环境中宿主菌的浓度，与单一噬菌体应用相比，噬菌体混合物和噬菌体-抗生素组合提供了更有前途的抑菌策略，因此，本研究中分离的噬菌体具有一定的应用开发潜力。

Abstract

In recent years, antibiotic-resistant pathogens have placed tremendous pressure on pathogen control within the livestock industry. Consequently, we have turned our attention to phages, a unique type of virus that has co-evolved with bacteria for an extended period. PE-1 is a bacteriophage strain capable of effectively controlling target pathogens and was isolated from samples collected from dead piglets suffering from intestinal disease and their living environment. EnterotoxigenicEscherichia coli(ETEC) K88 was employed as an inhibitory target to characterize the growth characteristics and in vitro antibacterial effects of bacteriophage PE-1. Morphological analysis tentatively classified phage PE-1 as belonging to the Podoviridae family. The one-step growth curve revealed that phage PE-1 had a short latent period of 10 min, a rise period of 20 min, and a burst size of 13 PFU/cell. The optimal multiplicity of infection (MOI) for phage PE-1 is 10, and the phage maintained normal activity at pH levels between 4−11 and temperatures no higher than 55 °C. Through two in vitro simulated test experiments, we evaluated the antibacterial efficacy of the bacteriophage. Our findings indicated that bacteriophage PE-1 delayed the growth activity of ETEC K88 by more than 2 h and reduced the proliferation rate of the host bacteria under infection conditions. Moreover, the bacteriophage decreased the concentration of host bacteria that reached the stationary phase. After inoculating the host bacteria with the optimal MOI, the host bacteria concentration dropped by nearly three orders of magnitude after 4 h. In conclusion, bacteriophage PE-1 demonstrates potential as an antibacterial agent for ETEC K88.

专家介绍

孟祥晨教授

东北农业大学食品学院

孟祥晨，东北农业大学乳品科学教育部重点实验室/食品学院教授、博士生导师，食品发酵工程二级学科带头人，乳品科学教育部重点实验室乳品微生物及生物技术平台首席专家。爱尔兰UCC大学访问学者，美国犹他州立大学高级访问学者。中国畜产品加工研究会常务理事；国家食品药品监督管理局食品安全专家；中国奶业协会理事；农业部农产品加工标准化技术委员会委员。

主要从事乳品科学与技术，食品微生物与生物技术，食品发酵等领域的教学和科研工作。先后主持、参加国家自然科学基金、教育部创新团队、“863”项目、国家科技支撑、省市各类课题20余项，获各级各类奖励8项。获授权专利10余项，转让科技成果2项。出版专著和教材10余部，发表学术论文200余篇。