食品界

西南林业大学阚欢教授、刘云高级实验师等：基于斑马鱼模型及网络药理学研究云南金花茶多酚的抗炎作用

植物多酚是植物体内的次生代谢产物，主要存在于植物体的皮、根、叶、果中。植物多酚表现出多种生理功能。云南金花茶（Camellia fascicularis）是一种富含多酚的药食同源植物，素有“植物界大熊猫”“茶族皇后”之称。斑马鱼作为一种新型模式脊椎生物，与人类基因有着87%的高度同源性,具有体积小、胚胎发育速度快、胚体透明等优点。

西南林业大学高妙姿、阚欢*、刘云*等采用斑马鱼模型评价云南金花茶多酚（CFP）抗炎活性，借助超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLCQ-TOF-MS/MS）技术鉴定其酚类化合物组成，并基于网络药理学方法获得CFP和炎症的共同作用靶点，通过基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析其作用特点，最后借助分子对接技术对多酚类关键成分和核心蛋白分子进行结合位点模拟验证，以期为深入研究CFP预防或治疗炎症的物质基础及作用机制提供数据支持。

1、最大耐受浓度分析结果

对3 dpf转基因中性粒细胞荧光斑马鱼卵黄囊进行LPS注射以建立细菌感染性炎症模型。由表1可知，在实验终点时，空白对照组和模型组斑马鱼均未见明显异常；而在实验组中，当CFP质量浓度为5.00、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL时会诱发斑马鱼毒性表现甚至死亡，故确定CFP对细菌感染性炎症模型斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）为2.50 μg/mL。

2、细菌感染性炎症治疗功效评价

不同质量浓度CFP及吲哚美辛处理后斑马鱼炎症部位中性粒细胞荧光情况如图1所示。在荧光显微镜下可以看出，模型组斑马鱼体内的炎症部位中性粒细胞主要集中在头部，经不同质量浓度CFP或吲哚美辛处理后，其中性粒细胞数量明显减少，且随着CFP质量浓度增加，中性粒细胞数量减少越明显。由表2可知，与空白对照组斑马鱼炎症部位中性粒细胞数量（（5.000±0.476）个）相比，模型组斑马鱼中性粒细胞为（19.000±0.618）个，差异高度显著，表明模型建立成功。阳性对照组吲哚美辛（35.8 μg/mL）斑马鱼中性粒细胞为（9.000±0.792）个，且炎症消退作用为53%，与模型组相比差异高度显著，表明吲哚美辛对细菌感染性炎症模型斑马鱼具有炎症消退作用。CFP质量浓度为0.625、1.25 μg/mL和2.50 μg/mL条件下，斑马鱼中性粒细胞分别为（13.000±0.500）、（9.000±0.680）个和（8.000±0.467）个，炎症消退作用分别为32%、53%和58%，与模型组相比，0.625 μg/mL实验组的炎症消退作用不显著，1.25 μg/mL和2.50 μg/mL实验组具有高度显著的炎症消退作用；同时，CFP在1.25 μg/mL条件下，即可达到吲哚美辛为35.8 μg/mL时的炎症消退效果。综上，CFP对细菌感染性炎症具有较强的治疗功效。

3、CFP中的酚类化合物鉴定结果

通过保留时间、一级和二级质谱质荷比等信息，并对比已有文献，完成CFP酚类化合物的定性分析。结果显示，共鉴定酚类化合物21 个，主要包括木麻黄鞣质、原儿茶醛、表儿茶素、怒茶素、6-O-乙酰基熊果苷、鞣花酸、飞燕草素、3,3’,4-三甲氧基鞣花酸、3-羟基香豆素等（表3）。

4、有效成分潜在靶点获取

在SwissTargetPrediction数据库对21 个酚类化合物进行作用靶点检索，其中表儿茶素和(4S,5R,6S,7S,8R)-6-羟基-7(α-乙酰氧基苄基)-四氢呋喃并[3,2-b]未能找到相关作用靶点。通过UniProt数据库对另外19 个成分的作用靶点进行基因匹配，经整合后共获得210 个潜在靶点。利用Cytoscape_v3.7.2软件对“有效成分-作用靶点”网络进行可视化（图2），并借助“Network Analyzer”插件对其Degree值进行分析，Degree值越大，形状越大，筛选出排名靠前的6 个关键成分，分别为飞燕草素、3,3’,4-三甲氧基鞣花酸、鞣花酸、3-羟基香豆素、双洋槐儿茶素-儿茶素和6-O-乙酰基熊果苷。

5、炎症靶点获取

以“inflammation”为关键词，在DisGeNET和GeneCards数据库中检索炎症的作用靶点。将19 个有效成分作用靶点与在DisGeNET数据库检索到的577 个靶点和在GeneCards数据库检索到的10 950 个靶点构建Venn图（图3），得到32 个有效成分和炎症的交集靶点，交集靶点信息见表4。

6、PPI网络分析结果

将32 个交集靶点信息上传至STRING数据库得到PPI网络（图4），经分析可知，PPI网络中有32 个节点和97 条边，平均节点度为6.06。借助Cytoscape v3.7.2中“CytoNCA”插件分析靶点的degree centrality值，筛选出排名前10的核心靶点，分别为GAPDH、SRC、EGFR、PTGS2、SIRT1、NFKB1、PTK2、MMP2、LYN和PIK3CG。

7、GO功能富集分析

以“P＜0.01”为评价标准，对32 个交集靶点进行GO功能富集分析。结果如图5所示，共得到18 个生物过程条目、4 个细胞组分条目和10 个分子功能条目。交集靶点主要涉及凋亡过程的负向调节（negative regulation of apoptotic process）、炎症反应（inflammatory response）、血小板激活（platelet activation）等生物过程；细胞质（cytoplasm）、质膜细胞质侧的外源性成分（extrinsic component of cytoplasmic side of plasma membrane）、应力纤维（stress fiber）等细胞组分；蛋白激酶活性（protein kinase activity）、酶结合（enzyme binding）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）结合、受体结合（receptor binding）等分子功能。

8、KEGG通路富集分析

以“P＜0.01”为标准，对32 个交集靶点进行KEGG通路富集分析。结果如图6所示，CFP预防或治疗炎症的作用靶点主要富集在花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）、低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、血小板激活（platelet activation）、癌症相关通路（pathways in cancer）等14 条信号通路上，且花生四烯酸代谢通路、HIF-1信号通路、血小板激活通路与CFP抗炎作用关系最为密切。

9、分子对接结果

运用AutoDockTools-1.5.7软件将关键成分与核心靶点蛋白分子进行分子对接。对接热图显示，6 个关键成分与10 个核心蛋白间均能在自然状态下对接，其中飞燕草素、3,3’,4-三甲氧基鞣花酸、鞣花酸等小分子与GAPDH、PTGS2、MMP2、EGFR、SIRT1等蛋白质间均具有较好的结合活性，且飞燕草素与MMP2，3,3’,4-三甲氧基鞣花酸与GAPDH、PTGS2、MMP2间呈现强烈的结合活性（图7）。

借助PyMOL软件将结合能靠前的对接结果进行可视化分析。结果如图8所示，云南金花茶中关键成分3,3’,4-三甲氧基鞣花酸通过与GAPDH的ALA-238、ASN-239、PRO-236、LEU-203残基形成8 条氢键，与MMP2的LEU-137、PRO-134、ILE-141残基形成4 条氢键，与PTGS2的TYR-130、GLY-135、GLN-42、CYS-41、CYS-46、HIS-39残基形成7 条氢键；飞燕草素通过与MMP2的ILE-141、ASN-147、LEU-137、GLY-135残基形成5 条氢键；鞣花酸通过与GAPDH的GLN-204、ALA-238、ASN-239、PRO-236、LEU-203残基形成8 条氢键，与EGFR的ASP-1014、ALA-1013、GLN-791、LYS-852、THR-790、ARG-776残基形成9 条氢键。以上小分子均能稳定地置于受体蛋白的活性对接口袋中发挥抗炎作用。

讨论

炎症，即人们常说的“发炎”，其中慢性炎症常常会诱发各种疾病，如有研究发现动脉粥样硬化患者体内，促炎症细胞因子肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6分泌量等增加，会造成机体自身的免疫攻击，诱发冠心病，严重危害身体健康。

据报道，CFP通过下调促炎症细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达，来抑制核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活，从而发挥抗炎作用。基于此，为进一步验证其抗炎机制，本研究通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定出21 个酚类化合物，然后基于网络药理学的方法，筛选出飞燕草素、3,3’,4-三甲氧基鞣花酸、鞣花酸等Degree值排名靠前的关键成分，表明其可能是主要的抗炎化合物。

PPI网络及KEGG通路富集分析结果显示，CFP主要通过作用于GAPDH、SRC、EGFR、PTGS2、SIRT1、NFKB1等核心靶点来调控花生四烯酸代谢、HIF-1信号通路、血小板激活等信号通路。HIF-1是缺氧适应性反应的主要调控因子，血小板活化会使炎症因子分泌量增加，造成急性心肌梗死。本实验还存在相关靶点信号通路缺乏验证等局限性，后续还需进一步开展研究。

结论

本研究在利用斑马鱼模型评价CFP抗炎活性的基础上，通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定出21 个酚类化合物，利用网络药理学的方法筛选出19 个有效成分和32 个交集靶点，分析发现CFP可能通过细胞增殖的正向调节、细胞质、ATP结合等生物学过程，作用于GAPDH、PTGS2、MMP2等核心靶点，进一步调控花生四烯酸代谢、HIF-1信号通路、血小板活化等信号通路，发挥抗炎作用。分子对接结果显示，CFP与炎症靶点间存在较好的结合活性，表明云南金花茶发挥抗炎作用时具有多成分、多靶点、多途径的特点。

本文《基于斑马鱼模型及网络药理学研究云南金花茶多酚的抗炎作用》来源于《食品科学》2023年44卷11期134-142页.作者：高妙姿，唐军荣，邓佳，向建英，阚欢，赵平，张颖君，张贵良，刘云. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220525-318.