黑龙江大学生命科学学院王雨亭、雷虹*、冯磊*等采用低铁饲料和菌群剔除方法，建立IDA模型及无菌IDA模型，灌胃黑木耳黑色素，分析血象指标，研究肠道菌群在黑木耳黑色素改善IDA中发挥的作用，采用高效液相色谱-质谱联用技术分析IDA模型及无菌IDA模型小鼠黑色素处理3 周后的粪便代谢差异，筛选具有显著差异的代谢物及作用通路，从代谢组学角度研究在肠道菌群参与下，黑木耳黑色素改善IDA的代谢通路及黑色素改善贫血的作用机制，为黑木耳黑色素改善贫血的作用机理提供新的思路和依据。

将动物模型分为空白对照组（Control组）、缺铁性贫血组（IDA组）、缺铁性贫血＋黑木耳黑色素组（IDA＋M组）和缺铁性贫血＋抗生素鸡尾酒＋黑木耳黑色素组（IDA＋ABX＋M组）。《常用医药研究动物模型》一书规定的IDA判断依据为血红蛋白≤100 g/L、红细胞压积下降和红细胞平均体积减少。饲喂2 周低铁饲料进行IDA造模，2 周后IDA小鼠血红蛋白质量浓度降低至（86.67±4.37）g/L。同时，红细胞压积、平均红细胞体积、血小板数目等贫血指标显著下降（数据未显示），表明造模成功。造模成功后，对IDA＋ABX＋M组小鼠抗生素鸡尾酒处理7 d，与Control组小鼠相比总菌DNA相对表达量显著下降，表明肠道菌群剔除成功，可以进行后续实验。

如图2所示，始终将各组小鼠饲喂量保持一致，且进行实验的初始小鼠体质量控制在无显著差异范围内。在实验结束时，IDA、IDA＋ABX＋M组小鼠与Control组相比体质量极显著下降。这可能是因为IDA对机体消化系统造成危害，特别是肠道损伤，影响食物的消化吸收，导致体质量下降。灌胃黑色素显著改善IDA小鼠体质量，与IDA组相比，灌胃黑色素3 周后IDA＋M组小鼠体质量显著增加，与Control组小鼠相比无显著差异。有趣的是，采用抗生素鸡尾酒方法进行菌群剔除后，再补充黑木耳黑色素无法改善IDA小鼠体质量，即IDA＋ABX＋M组与IDA组小鼠体质量无明显差异。上述结果表明黑木耳黑色素可以改善和恢复IDA小鼠体质量，而且黑木耳黑色素发挥作用可能与肠道菌群有关。

2、黑木耳黑色素对IDA小鼠贫血症状的影响

如图3所示，与IDA组相比，灌胃黑色素3 周后，IDA＋M组血红蛋白质量浓度、红细胞压积、平均红细胞体积、血红蛋白质量浓度均有明显提高，与Control组无显著差异；相反，IDA＋ABX＋M组所有贫血指标均未恢复正常，与Control组存在极显著或高度显著差异，表明剔除肠道菌群，补充黑木耳黑色素无法改善IDA贫血症状。上述结果同样表明黑木耳黑色素具有改善IDA小鼠贫血的功能，但肠道菌群可能在其中发挥重要作用。同时，本实验的结果显示黑木耳黑色素治疗和改善IDA同样也需要肠道菌群参与。以上结果表明肠道菌群或可作为IDA的治疗靶点。

3、样本可靠性分析

代谢组数据稳定性及可重现性是其研究精准有效的关键要素，增加质控样本可以考察系统的稳定性及数据的可靠性。本研究通过将预先收集的质控样本均匀插入序列中上机检测，图4A、B分别为质控样本正、负离子模式总离子流图，结果显示，色谱峰响应强度及保留时间基本呈重叠现象，说明其误差较小、数据真实可靠。图4C～F是IDA＋M组与IDA＋ABX＋M组粪便样本的正、负总离子流，图上各组色谱峰保留时间大致相同，表明数据重复性良好。两组之间在相同时间内色谱峰高度各不相同，意味着两组样本中肠道代谢物出现了差别，表明肠道菌群影响了IDA小鼠消化黑木耳黑色素的代谢模式。

4、肠道菌群对代谢轮廓的影响

采用主成分分析（PCA）方法将经过预处理两组小鼠样本的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱代谢物数据进行整体分析，结果发现IDA＋M组与IDA＋ABX＋M组样本能够被显著分开，说明在肠道菌群参与下，补充黑木耳黑色素的IDA小鼠体内代谢物发生显著变化，贫血症状改善明显（图5A、B）。为了进一步验证两组样本分离，并筛选关键代谢物，如图5C、D所示，进行OPLS-DA分析，结果显示IDA＋M组与IDA＋ABX＋M组样本显著分离，数据模型中有较好的拟合度及预测能力（正离子：R²X＝0.72、R²Y＝0.997、Q²＝0.986；负离子：R²X＝0.744、R²Y＝0.996、Q²＝0.986）。通过置换检验进行模型验证，200 次置换检验后正离子模型的截距R²＝0.604 1、Q²＝－0.509（图5E），负离子模型的截距R²＝0.577 8、Q²＝－0.399 4（图5F），此数据表明模型有极好的预测能力与可靠性。位于左侧的R²Y数值均低于最右侧的R²Y数值，且Q²的回归线截距为负，说明未发生过拟合，表明模型良好的区分及预测能力。

为了进一步分析肠道菌群参与黑木耳黑色素改善IDA的相关差异代谢物，根据VIP＞1.5、P＜0.05、FC＞1.5或＜0.66标准，选择OPLS-DA分析差异贡献值较大的代谢物。通过HMDB和KEGG在线数据库筛选鉴定出76 个肠道菌群参与黑木耳黑色素改善IDA的相关代谢物，与IDA＋ABX＋M组相比，IDA＋M组中上调41 个代谢物，下调35 个（图6A）。筛选得到的差异代谢物通过层次聚类分析能更直观显示出样本之间的关系以及代谢物在不同样本中的表达模式上的差异，如图6B所示，差异代谢物能够显著区分IDA＋M组和IDA＋ABX＋M组，剔除肠道菌群的IDA＋ABX＋M组小鼠体内生物喋呤、毒素等物质显著上调，表明小鼠处于炎症损伤状态。谷胱甘肽代谢途径相关代谢物半胱氨酰甘氨酸、抗坏血酸以及谷酰基异亮氨酸、γ-谷氨酰基亮氨酸等γ-谷酰基氨基酸代谢相关代谢物等参与氧化还原的代谢产物大量积累以及13S-羟基十八碳二烯酸、2,4-二羟基-2-庚烯二酸、四氢可的松等脂质水平的上调进一步证明了剔除肠道菌群的IDA小鼠的氧化应激及脂质过氧化的病理状态。相反，肠道菌群存在条件下，补充黑木耳黑色素后小鼠体内炎症损伤及氧化应激相关代谢物显著降低，而色氨酸代谢通路代谢物被显著激活。

6、代谢通路富集分析

将筛选的差异代谢物进行通路富集分析，结果如图7A所示，共筛选到色氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，抗坏血酸和醛酸代谢，谷胱甘肽代谢，酪氨酸代谢，戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化和类固醇激素生物合成7 条通路。其中色氨酸代谢和谷胱甘肽代谢通路最为显著。研究结果显示，在肠道菌群的参与下，黑木耳黑色素干预显著改善了IDA小鼠的贫血症状，伴随着色氨酸代谢产物5-羟基吲哚乙酸、N-甲酰犬尿氨酸的显著积累（图7B）。本研究结果表明，剔除肠道菌群后补充黑木耳黑色素无法改善IDA小鼠贫血症状，且伴随着谷胱甘肽代谢产物L-半胱氨酸甘氨酸、L-抗坏血酸以及γ-谷氨酰循环的代谢产物γ-谷氨酰亮氨酸、谷氨酰基异亮氨酸的显著上调（图7B），表明缺乏肠道菌群时，黑木耳黑色素不能正常消化和降解，无法恢复IDA小鼠氧化还原平衡状态和改善体内炎症损伤，这也可能是IDA＋ABX＋M小鼠体质量减轻和贫血不能改善的原因。