东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室的Xiaoqian Chen（第一作者）和刘丽波教授（通信作者），张国芳讲师（通信作者）等利用多孔石墨碳吸附结合高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）研究了乳糖的存在对母乳低聚糖（HMOs）含量测定的影响。使用石墨碳管动态富集母乳中的低聚糖，以减少乳糖对测定的干扰。研究发现，去除90%以上的乳糖后得到的HMOs的质量浓度更准确。建立了一种简便、精确、可靠定量母乳中的低聚糖方法，为确定HMOs发挥具体功能和在何种浓度下发挥作用提供参考，也为研究母乳中不同HMOs成分和浓度对婴儿的影响提供参考。Introduction
母乳中含有生物活性蛋白、脂类和碳水化合物。成熟母乳中的低聚糖含量是仅次于乳糖的第二大碳水化合物成分和第三大营养成分，比牛乳中的低聚糖含量高100 倍以上，高达5~15 g/L。HMOs有200多种，通常由短链和长链结构组成，比例为9:1，其中20 种被称为主要的HMOs。由于母体的遗传因素，HMOs存在多种异构体和复杂的结构。HMOs在新生儿发育中起着不可替代的作用，它可以保护新生儿，刺激先天和适应性免疫的发育。它对婴儿健康也有许多有益的影响，如保护婴儿免受病原体感染，支持肠道发育，促进屏障功能，刺激免疫发育，促进免疫耐受并喂养肠道微生物。此外，HMOs还可作为具有直接杀灭细菌或真菌作用的抗微生物剂，或模仿上皮细胞表面糖萼结构并用作可溶性诱饵受体以阻止潜在病原微生物附着的抗粘剂。因此，HMOs的开发具有重要价值，深入了解其组成、结构、功能和生物活性对于开发更接近母乳的婴儿配方乳粉至关重要。建立合适的、准确的HMOs检测方法是十分必要的。Results
母乳中乳糖的存在会影响低聚糖含量的测定结果
与以往测定HMOs的预处理方法相比，本研究增加了去除乳糖的步骤，以避免乳糖的存在对HMOs测定产生影响。向去除脂肪和蛋白质后的母乳中加入β-半乳糖苷酶分解乳糖，然后用石墨碳管动态富集HMOs，可实现HMOs的损失小于5%，乳糖去除率超过90%，减少了乳糖对测定的干扰。得到的样品溶液用比色法测定总糖含量，用酶法测定乳糖含量。结果表明，本研究中的母乳样品预处理方法可以较好地避免乳糖对HMOs测定的影响（图1）。 
图1 从母乳中提取低聚糖时乳糖与总糖的比率
母乳低聚糖离子扫描结果
对10种HMO标准品分别进行了母离子全扫描，Scan type选择为MS2 scan。在正离子模式下，从表2可以看出，10种HMO均出现了加钠母离子峰。
子离子扫描结果
通过对10 种HMO标准品的加钠母离子进行子离子扫描，得到10 种HMO的离子对，Scan type选择为Product Ion。从表3可以看出，这10 种HMO均找到了响应较好的子离子。
通过比较质谱上不同碰撞能量下的离子碎片强度，对已经找到的10种HMO标准品的离子对进行碰撞能量优化，优化过程用扫描谱图表示（图2），优化结果和得到的参数见表4。10 种HMO标准品依次为2'-FL、3-FL、3'-SL、6'-SL、LNFP I、LNDFH II、LNFP V、LSTa、LSTb和LSTc，它们在标准品多反应监测中的最佳碰撞能量为43、52、39、50、75、84、66、49、60、54 V。 表1 10 种HMOs.的基本信息
表2 10 种母乳低聚糖标准品全离子扫描结果
表3 10 种母乳低聚糖标准品子离子扫描结果
表4 10 种母乳低聚糖标准品多反应监测优化结果
(A) 2’-FL，(B) 3-FL，(C) 3’-SL， (D) 6’-SL，(E) LNFP I， (F) LNDFH II， (G) LNFP V，(H) LSTa， (I) LSTb， (J) LSTc。
反复优化液相条件，直到设定的进样时间对HMOs的分离影响较小。研究从流动相的比例上进行了优化，通过反复试验得到了最佳的梯度条件：0~10 min，5%~25% A；10~15 min，25% A；15~20 min，25%~35% A；20~-21 min，35%~90% A；21~24 min，90% A；24~25 min，90%-5% A；25~40 min，5% A。采用最佳液相色谱条件后，发现HMOs之间的分离效果较好，因此优化后的条件可用于10 种HMOs的测定和分析。 使用优化的液相质谱条件对浓度依次为1.0、5.0、10、20、50 mg/L的HMOs稀释标准溶液进行分析。通过峰面积（Y）对样品质量浓度（X）的线性回归，绘制出标准溶液的工作曲线。如表5所示，10种HMOs的标准曲线的相关系数（R2）都大于0.995。2'-FL和3-FL在1.50~100.00 μg/mL的质量浓度范围内表现出良好的线性，其余8种HMO在0.75~50.00 μg/mL的质量浓度范围内表现出良好的线性。这一结果表明，各HMO的线性和稳定性均良好，说明本研究构建的方法具有较高的灵敏度。 为了评估方法的准确性和精确性，将HMOs标准品以3 种不同的浓度水平（高、中、低）加入到母乳中。在3 d内进行了三次重复测定，结果总结在表6中。经过预处理的样品重复分析后，每种HMO检测结果的相对标准偏差（RSD）值在1.67%~4.34%之间，均小于5%，说明样品的稳定性良好。加入加标样品后检测，每种HMO样品检测的RSD小于10%，标准偏差（SD）小于5%。这表明该方法的准确性很好。平均加标回收率为98.74%~102.26%，回收率表明HMOs在去除乳糖的过程中无明显损失。因此，本研究建立的方法可用于母乳中10 种HMOs的检测和分析。 为避免实验误差，HMOs成分的测定按照优化后的方法进行，对母乳样品进行了3 次重复测定。检测结果见表6。研究通过石墨碳管富集样品中的低聚糖，10 种HMOs的RSD均小于5%，证明方法的精度较高。表明该方法能较好地排除乳糖的影响，使HMOs的测定更加准确、简便。
表6 标准品添加到母乳低聚糖样品种的测定结果及精度和准确性 
与以往报道的方法相比，本研究采用的HMOs提取方法简单、准确，能有效去除90%的乳糖，减少乳糖对HMOs检测的干扰，所需样品量少。结果也证实了该方法的简便性、重现性和精确性较好，所测得的HMOs质量浓度更准确。此外，每位妇女的母乳中含有的低聚糖数量存在差异，在今后的研究中还应更深入地探究不同来源的母乳对低聚糖种类及含量的影响。这项研究为进一步深入探究HMOs的功能价值奠定了良好的基础，同时也为开发营养结构更合理、更接近母乳的婴儿配方乳粉奠定了基础。
Human milk oligosaccharides (HMOs) have become a hot topic in the field of maternal and infant nutrition and health research, and are also widely used as innovative functional ingredients in infant formulas, but their complex structure makes its isolation and analysis difficult. This paper presents a simple method for the extraction and analysis of HMOs. The effect of the presence of lactose on the determination of HMO content was investigated by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS). Human milk is dynamically enriched with oligosaccharides using graphite carbon pipes to reduce the interference of lactose with the assay. It was found that the mass concentrations of HMOs obtained after removing more than 90% of lactose were more accurate. 2’-Fucosyllactose (2’-FL) and 3-fucosyllactose (3-FL) were linear in the range of 1.50–100.00 μg/mL (R2 > 0.997), and the remaining eight HMOs were linear in the range of 0.75–50.00 μg/mL (R2 > 0.995). Precision (relative standard deviation (RSD)) values for each HMO detection result ranged from 1.47% to 5.26%. Accuracy is from 98.74% to 102.26%. This analytical technique is a sensitive, precise, and accurate quantitative method for the quantification of ten HMOs in human milk. This method can provide accurate and reliable quantification of the oligosaccharide content of human milk, providing a reference for determining the specific functions performed by HMOs and at what concentrations they function, as well as for studying the effects of different HMO components and concentrations in human milk on infants..
刘丽波，教授/博士生导师。研究方向为膳食成分营养与安全，功能性乳制品研发，益生菌定向代谢调控，犹他州立大学西部乳品研究中心访问学者。主持国家自然科学基金、国家教育部长江学者和创新团队发展计划、“十三五”“十一五”国家科技支撑计划、黑龙江省自然科学基金重点项目等30余项。获得黑龙江省高校科学技术奖一等奖2 项，科技进步三等奖1项；发表科研论文76 篇，SCI/EI文章40余篇，获得授权专利14 项。主编和副主编国家级出版社专著及教材计2 部。指导本科生参与国家、省级竞赛，获得多次奖励。 
张国芳 讲师
东北农业大学食品学院 乳品科学教育部重点实验室
张国芳，讲师，2021年东北农业大学“学术骨干”。主要研究方向为乳品发酵、功能益生菌定向筛选、乳功能成分研究。目前累计发表论文15 篇，其中近3 年以第一作者/通信作者发表SCI论文5 篇（中科院2区以上）；参与完成“国家自然科学基金面上项目”“国家乳业技术创新中心创建重点项目、“国家重点研发计划、“黑龙江省自然科学基金杰出青年项目”等课题7 项；参与编辑教材《乳品分析》1 部；申请发明专利3 项。
