湖南大学朱向荣教授等：山苍子精油对柑橘意大利青霉的抑菌活性及作用机制
2023-09-01作者：来源：责任编辑：食品界
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柑橘是我国重要的经济水果之一，采后极易受到真菌病害的影响，导致果实严重腐烂，造成不必要的资源浪费。由意大利青霉（Penicillium italicum）侵染引发的青霉病是柑橘采收后发生的最普遍的一种病害，在果实采后运输、贮藏和销售等环节极易发生，造成巨大经济损失。苍子精油（LCEO）作为一种天然植物精油，具有独特的抗氧化、杀菌和抗真菌活性。LCEO及其主要成分柠檬醛对微生物具有很强的抗菌活性。
湖南大学生物学院隆平分院的孙畅，李湘和朱向荣*等人测定了LCEO对意大利青霉最小抑菌质量浓度（MIC），探究LCEO对柑橘意大利青霉菌丝生长、孢子萌发和抑菌活性影响。此外，还研究LCEO对柑橘意大利青霉细胞成分释放、胞外pH值及电导率的影响。本研究利用扫描电子显微镜（SEM）观察LCEO对柑橘意大利青霉菌菌丝表面形态变化的影响，采用碘化丙啶（PI）染色法检测孢子细胞膜完整性，并测定柑橘果实青霉病的发病率和病斑直径，评价LCEO对柑橘青霉病的防治效果，旨在为LCEO在柑橘采后青霉病控制的应用提供理论基础。
1 LCEO对意大利青霉的MIC
如表1所示，当LCEO质量浓度低于1.17 mg/mL，有菌落生长，当高于该质量浓度时，未见菌落生长，说明在该质量浓度梯度下意大利青霉的生长受到抑制。因此，1.17 mg/mL为LCEO对柑橘意大利青霉的MIC。
随着培养时间的延长，由孢子萌发的菌丝块逐渐扩展为菌落。如图1所示，培养7 d后，LCEO处理对意大利青霉菌丝生长有显著抑制作用，不同质量浓度处理组之间菌落直径差异显著（P＜0.05），其抑菌效果随LCEO质量浓度升高而增强，菌落直径逐渐减小。
如图2所示，对照组孢子芽管生长正常，几乎全部萌发，但LCEO处理对意大利青霉孢子萌发及芽管的形成有显著抑制和延缓作用，LCEO的抑制作用与其质量浓度呈正相关，即LCEO质量浓度越高，抑制作用越强，孢子萌发率越小。
如图3所示，随着LCEO质量浓度的增加，意大利青霉菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率均呈上升趋势。 
如图4所示，LCEO处理能显著增加意大利青霉细胞成分的释放，经LCEO处理30 min，意大利青霉培养上清液的OD260 nm较对照组显著增加，0.5 MIC、MIC、2 MIC处理组OD260 nm分别为0.194±0.028、0.434±0.053、0.763±0.022，显著高于对照组（0.002±0.001），说明LCEO破坏细胞膜完整性，导致细胞内大分子核酸等泄漏，OD260 nm明显增加；随后OD260 nm缓慢增加，LCEO处理组OD260 nm在120 min时达到峰值后基本保持恒定。随着处理时间的延长，对照组OD260 nm基本没有变化。结果表明，随着LCEO质量浓度的增加，核酸泄漏程度明显增加，表明LCEO对意大利青霉细胞膜有一定的破坏作用。
如图5所示，意大利青霉胞外电导率随着处理时间的延长和LCEO质量浓度的增加而升高，在0～30 min内电导率迅速增加，说明LCEO通过破坏意大利青霉的细胞膜，细胞膜通透性改变，电解质渗漏致使胞外电导率升高。
如图6所示，经LCEO处理后意大利青霉pH值呈上升趋势，表明胞内碱性物质渗出，pH值不断上升。
如图7所示，对照组意大利青霉菌丝形态正常、表面光滑，呈粗细均匀的线状（图7A），0.5 MIC处理组菌丝形态与对照组没有明显差异（图7B），但MIC LCEO处理后菌丝表面发生不可逆的形态变化，菌丝线性丧失，表面不再光滑，出现干枯、扭曲和皱缩，细胞内容物减少（图7C），2 MIC处理组菌丝体破坏更为剧烈，除较严重的皱缩外，细胞内容物泄漏更为严重，菌丝体呈干瘪、细小的形态（图7D）。
8 LCEO对柑橘意大利青霉孢子细胞膜完整性的影响
PI可穿透受损的细胞膜，使细胞核染色，因此PI染色通常用于检查细胞膜的完整性。如图8所示，与对照组相比，MIC的LCEO处理意大利青霉孢子后，暗场显示部分红色荧光（在图中用圆圈标出），LCEO质量浓度增加至2 MIC时，暗场显示出更多的红色荧光，对照组暗场未显示红色荧光，表明LCEO可破坏意大利青霉孢子的细胞膜完整性，从而使PI染液进入细胞内，LCEO质量浓度越高，意大利青霉孢子细胞膜受损程度越严重。
9 LCEO对柑橘果实青霉病发病率和病斑直径的影响
如图9所示，柑橘果实贮藏7 d后，对照组青霉病发病率为96.3%，其病斑直径达（28.82±2.88）mm，对照组果实腐烂严重，水渍状范围较大，表面霉斑呈绿色。
本实验研究LCEO对意大利青霉的抑制作用及作用机制。LCEO可有效抑制或延缓柑橘意大利青霉的菌丝生长和孢子萌发。LCEO质量浓度越高，抑菌作用越明显。当LCEO质量浓度进一步增加至1 000 mg/L时，观察到菌丝体的生长和孢子萌发几乎被完全抑制，菌丝体表面出现不可逆的形态变化，出现干枯、扭曲和皱缩等现象。实验结果表明，当加入0.5 MIC、MIC、2 MIC LCEO处理后，意大利青霉的OD260 nm、胞外电导率和pH值随着处理时间延长和LCEO质量浓度的增加而逐渐增加，且在0～30 min内迅速增加。以上结果表明，LCEO质量浓度越高，细胞的通透性增大，细胞壁及细胞膜的完整性被严重破坏，造成细胞组分渗出，最终致使细胞死亡。
通过SEM观察到LCEO导致菌丝体破坏严重和内容物丧失，这与细胞壁、细胞膜的支撑作用丧失紧密相关，结果表明，LCEO的抑菌作用通过破坏细胞膜进而阻断细胞的生长实现。在本研究中，PI染色结果显示，与对照组相比，经LCEO处理后在暗场中观察到红色荧光，表明其孢子的细胞膜完整性受到破坏。柑橘侵染实验发现，果实贮藏7 d后，对照组果实腐烂严重，病斑直径为（28.82±2.88）mm，而4 800 mg/L处理组柑橘果实发病率仅为3.70%、病斑直径为（2.58±0.29）mm，显著低于对照组，表明柑橘果实经LCEO处理能有效降低意大利青霉侵染引起的青霉病发病率，并能明显抑制意大利青霉菌在柑橘果实上的扩散蔓延，有效防治柑橘青霉病的发生。 本实验结果表明，LCEO对意大利青霉的MIC为1.17 mg/mL。LCEO可有效抑制或延缓柑橘意大利青霉的菌丝生长和孢子萌发，随着LCEO质量浓度的增加，其抑菌作用越显著。当LCEO质量浓度增加到1 000 mg/mL时，菌丝生长和孢子萌发抑制率分别为（88.17±0.30）%、（97.78±0.30）%。当加入0.5 MIC、MIC、2 MIC的LCEO处理后，意大利青霉的OD260 nm、胞外电导率和pH值随着处理时间延长和LCEO质量浓度的增加而逐渐增加，且在0～30 min内迅速增加。以上结果表明，LCEO通过细胞膜损伤机制抑制意大利青霉生长，随LCEO质量浓度的增加，细胞的通透性增大，细胞壁及细胞膜的完整性被严重破坏，造成细胞组分渗出，最终致使细胞死亡。LCEO处理的柑橘果实发病率和病斑直径随LCEO质量浓度的增加而显著下降（P＜0.05），其中质量浓度为4 800 mg/L时效果最好。LCEO可有效抑制柑橘意大利青霉菌的生长，研究结果可为开发绿色、安全、天然的新型保鲜剂提供理论指导。
本文《山苍子精油对柑橘意大利青霉的抑菌活性及作用机制》来源于《食品科学》2023年44卷11期，作者：孙畅，李湘，王银红，程小梅，李高阳，单杨，朱向荣。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20220820-238。
