食品界

Introduction

小麦是三大谷物之一，在世界各地广泛种植，在日常饮食中占很大比例。它可以用来做面包、馒头、啤酒、生物燃料等，营养丰富。然而，它也是8种主要食物过敏原之一，它的食用与几个健康问题有关。据流行病学调查，小麦过敏占食物过敏总发病率的11%~25%。中国的比例低于发达国家，但中国小麦中免疫球蛋白E (IgE)的阳性率从2007年到2010年呈逐年上升趋势。

酵母是一种传统的发酵剂，它是面粉和水的混合物，主要由酵母和乳酸菌等微生物发酵而成。微生物负责面团的酸化和外多糖、芳香化合物、酶和/或抗真菌化合物的合成。先前的研究表明，与商品酵母相比，酵母发酵在改善无麸质面包和其他小麦制品的营养、质地、流变学和保质期方面具有很大优势。此外，研究发现，面团中微生物的代谢对小麦蛋白的结构有一定的影响。在面团发酵过程中，酵母发酵产生的CO₂、酒精、蛋白酶、面筋含量和面筋指数都随着发酵时间的延长而显著降低。Joanna等发现酵母发酵增加了致敏性，但两者之间的关系尚未明确。乳酸菌和面包酵母发酵使小麦面筋的免疫反应性降低，但降低程度不显著。也有研究发现乳酸菌可以通过水解小麦和黑麦蛋白来减少过敏反应。

中国馒头是一种由酵母(老面头)自然发酵而成的主食，是由谷物、水和乳酸菌、酵母等活性微生物自然发酵而成的。这种发酵剂含有多种酵母和乳酸菌。然而，中药发酵剂对小麦蛋白及其致敏性的影响尚未见研究。在我们的日常生活中，发酵好的面团还要进行进一步的加工，如烘、烤、煮、蒸、炒等。在中国，馒头是最常见的主食，而面包则是西方国家的家常食品。不同的加工方法或发酵是否是影响小麦基质致敏性的关键因素，值得进一步研究。

多项研究表明，中国西部酵母的微生物群落与北方和南方酵母不同。因此，本研究收集了来自5 个不同地区的5 种中国传统发酵剂，探讨其对蛋白质特性和致敏性的影响。考虑到中西方饮食差异与变态反应发生率之间的关系，本文还将探讨不同烹饪方式对发酵小麦基质及其致敏性的影响。

Results and Discussion

中国传统发酵剂对小麦基质发酵特性的影响

从图1a可以看出，发酵过程中6 h内可溶性蛋白含量几乎没有变化，保持在0.8 mg/mL左右。但随着发酵时间的延长，各组可溶性蛋白含量均呈上升趋势。Gobbetti等也发现酵母发酵产生的有机酸可以增强乳酸菌特异性水解蛋白酶对面筋、淀粉和阿拉伯木聚糖的水解，或提供低pH值的发酵环境，增加面筋的溶解度和膨胀性，形成网状结构，从而提高蛋白质提取率。同时，酵母发酵过程中产生乙醇，乙醇可以溶解麦胶蛋白，提高可溶性蛋白的提取率。因此，可溶性蛋白提取率的提高可能是由于乳酸菌发酵产生乳酸，pH值降低，提高了面筋蛋白的溶解度。

测量pH值和TTA，结果如图1B和图1C所示。pH值一般在8 h内由5.0左右迅速下降到4.0，后期稳定在4.0左右。其中，四川万源发酵剂波动幅度最大。随着发酵时间的延长，可滴定酸度逐渐增加，最终稳定在27 mL。发酵过程中，酵母菌和乳酸菌分别产生CO₂和乳酸，导致pH值降低。在发酵后期，极低的pH值抑制了细菌的生长和繁殖。乳酸产量保持不变，pH值和TTA趋于稳定。

此外，已有研究证明乳酸菌有同型和异型两种代谢类型。在同乳酸菌代谢过程中，乳酸菌首先利用葡萄糖进行糖酵解途径产生丙酮酸，然后丙酮酸脱氢产生乳酸。对于异乳酸菌的代谢，乳酸菌从葡萄糖开始，通过葡萄糖6-磷酸途径产生乳酸，同时产生乙醇、二氧化碳和乙酸。在面团发酵过程中，乳酸菌除利用葡萄糖外，还可以利用其他己糖，借助特定的酶(水解酶、磷酸水解酶、异构酶等)在葡萄糖-6-磷酸阶段或果糖-6-磷酸阶段进入同质或异质代谢。无论何种代谢，都会产生乳酸，导致pH值降低。有研究指出，酵母和乳酸菌在24℃条件下对馒头进行24 h的发酵过程中，面团的酸度和可溶性糖含量随乳酸菌种类的不同而变化。乳酸菌产生的酸性环境会抑制酵母菌的生长，酵母菌也会影响乳酸菌的生长速度。需要注意的是，初始pH值的差异主要与不同地区传统发酵剂的酸度有关。

弱的分子内相互作用如疏水相互作用、氢键和范德华力在维持食物过敏原蛋白的三级结构及其致敏性中起着非常重要的作用。Gromiha等研究发现，在分子相互作用力中，维持包括过敏原在内的耐热蛋白稳定性的主要作用力是疏水相互作用。表面疏水指数是表征蛋白质表面疏水相互作用的定量指标。H₀在前4 h保持稳定，随着时间的延长逐渐升高。5个组中，巩义市增加最多，从3 179人增加到33 388人，是原来的10倍，西安和榆林分别增加了8.3倍，天长市和万源市分别增加了4.5倍和4.8倍(图1D)。这是由于发酵菌株在发酵前4 h内处于逐渐生长阶段。酵母在厌氧条件下发酵产生CO₂和乙醇，导致面筋结构改变，疏水性基团暴露，导致H₀显著升高。乳酸菌在发酵过程中产生乳酸，pH值降低，导致蛋白质表面解离残基减少，H₀升高。

图1 不同发酵剂发酵酵母过程中小麦蛋白的特性(A)可溶性蛋白含量；(B)发酵时pH值；(C)发酵过程中的TTA；(D)发酵过程中小麦蛋白H0的变化。

发酵对小麦蛋白谱及致敏性的影响

从图2a可以看出，在加工过程中，不同发酵组的蛋白质谱没有明显差异。在20~30 kDa左右，陕西西安组的分子量似乎弱于其他任何组。24 h后，80~120 kDa和20~30 kDa蛋白的分子量略有下降，说明一个或多个菌株可以分解或利用小麦蛋白。研究发现乳酸菌可以降解谷蛋白。有报道称，植物乳酸菌m616在面团发酵过程中对面团蛋白质有较强的降解作用，随着发酵时间的延长，总蛋白和蛋白质不同组分的含量逐渐降低。在本研究中，蛋白质的谱图几乎没有变化。这可能是由于传统发酵剂的细菌环境复杂，导致能够有效分解蛋白质的细菌的含量和生长受到其他细菌或代谢物的抑制。这导致蛋白酶含量和活性下降，直到发酵过程的后期才有蛋白质降解。

在发酵过程中，蛋白质被酸和酶降解。Gocmen等得出pH值对麦胶蛋白水解的影响最为重要，pH值为4.0时麦胶蛋白水解率最高。Cagno等发现乳酸菌发酵可以产生细菌素和一些重要的酶，这些酶具有蛋白质水解活性。它的蛋白质水解系统产生氨基酸和小肽，可以改变面团的蛋白质组成。

由图2b可知，一般情况下，不同传统发酵剂发酵面团的致敏性先升高后降低。不同地区的发酵剂对小麦蛋白的致敏性有不同的影响。平均致敏性以榆林组最强，其次为天常组。西安组和巩义组的结合能力下降最大，12 h时的变应原性最低。万源组的变应原性变化相对稳定。变应原性的增加可能与酵母发酵过程中产生的CO₂的拉伸作用有关。在拉伸效应的帮助下，更多的抗原决定因子暴露于抗体，导致更高的致敏性。因为产生二氧化碳的能力不同不同的发酵剂，对致敏性的影响最大时间也不同了。在发酵后期，用增加乳酸菌生产乳酸，面筋蛋白被水解，致敏表位被破坏。它结果表明，小麦内源蛋白酶(最适pH值3.0~4.0)通过面团酸化得到提高，并可进一步提高促进乳酸的特定蛋白酶水解活性细菌和进一步降解酵母中的蛋白质。在同时，如上所述，中国传统的起子有一个微生物环境复杂，酵母与乳酸菌的代谢与增效或拮抗作用密切相关。

另外，作者前期的实验比较了植物乳杆菌和酵母对发酵面团结构和致敏性的影响，发现酵母发酵面团的疏水性变化规律、二硫键含量和致敏性与中国传统发酵剂相似，说明在中国传统发酵剂发酵过程中，酵母发酵是影响小麦致敏性的主要因素。

图2 (A)不同发酵剂发酵过程中蛋白质组成的变化。a：陕西榆林; b:四川万源；c：安徽天昌；d：陕西西安；e：河南巩义；(B)不同发酵剂发酵对小麦蛋白致敏性的影响。

食品加工对小麦基质蛋白谱及致敏性的影响

根据5种发酵剂的比较结果，选择四川万源发酵剂的发酵样品进行烘烤或蒸煮处理，因为其致敏性较低。采用相同质量的蛋白样品进行SDS-PAGE实验(图3A)。结果表明，随着蒸煮和烘烤时间的增加，蛋白质含量逐渐降低。与蒸制后的基质相比，30 min后的蛋白染色凝胶上仅能隐约看到焙烧后基质的蛋白质轮廓。此外，发酵组与未发酵组之间的蛋白质轮廓变化不大。有研究发现，小麦蛋白在热蒸汽作用下会相互转化，水溶性蛋白和面筋转化为剩余蛋白，但总蛋白含量保持不变。在蒸煮过程中，蛋白质分子受热变性，导致蛋白质空间结构发生变化，破坏原有的肽键序列，促进小分子量蛋白质的结合和凝固，从而成为大分子残留蛋白的一部分。在蒸煮过程中，由于热蒸汽的作用，蛋白质的结构发生变化，肽键序列被破坏。热效应还促进小分子量蛋白结合形成一部分大分子蛋白，同时小麦蛋白在烘烤过程中被加热降解。

由图3B可以看出，两种热处理后小麦基质的致敏性均显著下降，且烘培处理的下降幅度大于蒸煮处理。发酵对烘麦基质的致敏性影响不大，但对蒸麦基质的结合能力有促进作用。以往的研究发现，在蒸汽基质中只存在强束缚水和弱束缚水。在蒸煮过程中，弱结合水逐渐变成强结合水，导致水与蛋白质的羧基或氨基结合增加，结合力增加。因此，抗原决定因子的构象被水保护，这导致比烘烤样品更高的结合能力。发酵样品的高致敏性可能是由于发酵后蛋白质中暴露了更多的致敏基团。

图3 (A)蒸烘加工对小麦蛋白质组成的影响。a：蒸；b:发酵蒸；c：烘烤；d：发酵烘烤；(B)蒸烘加工对小麦致敏性的影响。

Conclusion

本研究比较了中国不同地区5种发酵剂发酵的小麦基质的致敏性。本研究数据表明，发酵12 h内不同组间蛋白质谱无显著差异。随着发酵的进行，特别是pH值降低到3.0~4.0，致敏性也随之降低。不同的发酵剂对小麦蛋白的致敏性有不同的影响，这可能与酵母的发酵能力、CO₂产量、乳酸、酶和其他代谢物有关。烘烤可诱导蛋白质降解或相互转化，降低小麦的致敏性。因此，为了降低小麦在食品加工中的免疫反应性或生产低过敏性食品，需要选择合适的发酵剂、发酵时间和烹调方法。

Effect of thermal processing and fermentation with Chinese traditional starters on characteristics and allergenicity of wheat matrix

Huan Rao^a,b, Xi Li^b, Wentong Xue^b,*

^a College of Food Science and Biology, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China

^b College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

*Corresponding author.

Abstract

Wheat allergy has become a serious health threat worldwide and its prevalence has increased alarmingly in the past few years. Factors such as food matrix and food processing may alter the structure of wheat proteins, and hence affect its allergenic properties. However, few reports have focused on the influence of Chinese traditional starter fermentation on wheat allergy. In this study, 5 starters from different regions of China were used for fermentation, and protein characteristics were monitored by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, and immunoreactivity analyzed by immunoassay with allergenic serum was obtained from New Zealand white rabbits. The allergenicity of steamed and baked matrices was also evaluated. The results showed that the allergenicity of wheat dough was basically increased at the beginning and then decreased during fermentation, but specific trends depend on different starters. With the progress of fermentation, especially as pH value decreased to 3.0–4.0, the allergenicity decreased significantly. Baking and steaming can reduce the allergenicity of wheat matrix, but fermentation is not a key factor affecting the allergenic activity of proteins. Our results can provide a theoretical basis for controlling wheat allergenicity in food processing or producing hypoallergenic food.

Reference:

RAO H, LI X, XUE W T. Effect of thermal processing and fermentation with Chinese traditional starters on characteristics and allergenicity of wheat matrix[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(3): 789-794. DOI:10.1016/j.fshw.2022.09.013.