西南民族大学郝刚副教授等:低盐环境下蛋白质氧化对牦牛肌肉结构及持水性的影响

2023-09-01作者:来源:责任编辑:食品界 字体A+AA-

牦牛起源于我国,是一个古老而原始的牛种。牦牛肉含有丰富的蛋白质、氨基酸和矿物质元素,其中花生四烯酸、亚油酸等营养成分显著高于黄牛肉。肉的保水性是指肌肉在外力作用下保持其原有水分与添加水分的能力,是衡量肉品质的重要指标之一。肌肉在加工、贮存过程中发生氧化。目前,大多数研究者主要通过Fenton氧化体系模拟蛋白氧化,蛋白氧化会导致蛋白肽链骨架断裂,肌纤维束间隙增大,使其肌肉持水性降低,品质下降。NaCl对肉持水性和蛋白质氧化方面具有重要影响。

西南民族大学食品科学与技术学院胡婷、屈 莎、郝刚*等人以牦牛肉为研究对象,在低盐环境下改变肉腌制环境的pH值并通过Fenton体系模拟氧化,预测牛肉在贮藏等过程中汁液损失和质量变化,旨在为完善肉品保水性理论以及质量控制提供理论依据。

1 氧化对肌肉中TBARS值的影响

如图1所示,氧化程度≥20 mmol/L时,肌肉样品中的TBARS值相对空白显著提高(P<0.05)。TBARS值随着氧化程度的增加而增加,说明牦牛肉随氧化程度的增加脂质氧化越严重。此外,pH 5.0时TBARS值较pH 8.0时高,可能是因为血红素蛋白结构在碱性环境下更稳定。有研究发现,酸性环境下血红素蛋白会发生显著的构像变化,血红蛋白越展开,其血红素基团越展开,这会增加其促氧化活性。

2 氧化对羰基含量的影响


如图2所示,未氧化组与氧化程度为10 mmol/L H2O2之间的羰基含量具有显著差异(P<0.05),且羰基含量随着氧化程度的增加整体呈增加趋势,与TBARS值的变化趋势一致。这是由于一些氨基酸残基在活性氧的作用下转化为羰基衍生物导致羰基含量增加。另外,脂质氧化产生二级二羰基产物,如丙二醛,这些产物与肌球蛋白相结合生成蛋白相结合的羰基。

3 氧化对总巯基含量的影响

如图3所示,巯基含量随着氧化程度的增加而降低,氧化程度为10 mmol/L时,巯基含量显著低于对照组(P<0.05)。蛋白质在羟自由基的诱导下会导致巯基氧化成二硫键,从而导致蛋白质巯基含量的下降。此外,pH 8.0相对于pH 5.0时具有更低的巯基含量。说明蛋白分子经过碱处理后结构发生了明显变化,暴露更多的—SH;另外,碱性条件下有利于半胱氨酸残基去质子(SH→S-),更容易被氧化成二硫键。

4 SDS-PAGE分析


由图4可知,分子质量约200 kDa处,在非还原胶中被减弱的蛋白条带并没有在还原胶中恢复,但在分子质量约63、25~35 kDa和17~20 kDa处出现新的条带,说明肌原纤维蛋白发生降解。非还原胶中,分子质量48 kDa(肌动蛋白)处的条带随着氧化程度增加逐渐减弱,但在还原胶中恢复到与空白接近的水平,说明蛋白氧化除了通过二硫键的方式发生交联外还存在非二硫键的交联方式,如酪氨酸与酪氨酸反应生成二酪氨酸,Shifit碱反应等。另外,非还原胶中,分子质量100(磷酸化酶b)、48~63 kDa(丙酮酸激酶)处的条带随着氧化程度的增加逐渐减弱。此外,非还原胶中,分子质量约63(丙酮酸激酶)、48(肌动蛋白)、35 kDa(甘油醛磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶)处的蛋白条带在碱性环境中比在酸性环境中更加清晰。可能是因为在pH 5.0时蛋白分子间形成的共价键更多是二硫键,在还原胶中通过β-巯基乙醇被还原,使分子质量在48 kDa处的蛋白条带颜色较pH 8.0时颜色深。

5 氧化对肌肉离心损失的影响


由图5可知,氧化程度为1 mmol/L时,离心损失最小,说明此时肌肉的持水性最大。可能是因为蛋白质经过氧化后,氨基酸带电基团发生修饰,导致蛋白质电荷发生改变;蛋白质的等电点会往酸性方向偏移,导致肌球蛋白和肌动蛋白丝上净负电荷增加,因此,低氧化程度下持水性的增加可能是增加的净电荷作用强于蛋白质交联的作用,从而提高肉的保水性。随后,随着氧化程度的增加,离心损失增加且氧化程度为40 mmol/L时与空白组差异显著(P<0.05)。这可能是因为,Fenton氧化产生活性氧使细胞膜上的脂质氧化,引起自由基链式反应,导致不饱和脂肪酸含量下降,膜流动性降低,通透性增加,自由水在外力的作用下难以被束缚流失到细胞外,使肌肉持水性下降,肉的品质降低。此外,发现pH 5.0时离心损失大于pH 8.0,可能是因为pH 5.0接近于肌原纤维蛋白的等电点,使蛋白分子呈电中性与水的结合能力降低;另外,肌原纤维间排斥力降低,蛋白质相互靠近,使得肌原纤维内部空间减小,对水分的保留较少。

6 氧化对肌肉蒸煮损失的影响


由图6可知,蒸煮损失随着氧化程度的增加而增加,与空白组相比,10 mmol/L H2O2处理组蒸煮损失显著增加(P<0.05)。可能是因为蛋白氧化交联使肌纤维丝间距减小,胞间距增大,使水合能力随着氧化程度的增加而增加,但当肌肉在加热环境下反而会排出更多水分。通过改变肉的pH值,发现空白组的蒸煮损失在pH 8.0时较pH 5.0低,这与离心损失的变化趋势一致,这可能是因为pH 8.0远离蛋白等电点使其静电斥力增加,从而增加其容水空间,另外带电荷的蛋白与肌肉中的游离水紧密结合使其持水能力增加。

7 不同氧化条件下T2的变化

由图7可知,图谱中共有3 个峰,其中T2 0.285~4.642 ms处的峰对应结合水弛豫时间(T2b);T2 18.738~114.976 ms处的峰对应不易移动水弛豫时间(T21);T2 174.753~705.48 ms处的峰对应自由水弛豫时间(T22)。P2b、P21和P22分别是结合水、不易流动水和自由水的相对含量。

由图8可知,结合水和自由水占比较小,都低于5%,不易移动水占绝大多数,比例超过90%。随着氧化程度的增加,P21所占比例降低,P22所占比例增加。pH 5.0 60 mmol/L H2O2处理组与空白组相比,牦牛肉的结合水从2.88%下降到1.50%,不易流动水稍微下降,自由水从1.79%增加到3.61%;pH 8.0 60 mmol/L H2O2处理组与空白组相比,牦牛肉的结合水从3.14%下降到1.77%,不易流动水从95.75%下降到95.32%,自由水从1.11%增加到2.92%。这表明随着氧化程度的增加自由水会增加,结合水和不易流动水略微下降。同一H2O2浓度下,pH 8.0时自由水含量低于pH 5.0。结合水变化较小,可能是因为该部分是与蛋白质等大分子结合最为紧密的水,且不易受蛋白质结构和电荷变化的影响。不易流动水存在于纤丝、肌原纤维及膜之间。自由水是存在于肌细胞外间隙中的水分,随着氧化程度的增加不易流动水下降,自由水增加,可能是因为蛋白质氧化程度增加,导致水与蛋白质分子间的结合作用力减弱,从而增加水分子的流动性。在肉制品的加工中自由水极易损失。Bertram等从猪肉中提取肌原纤维蛋白并用低场核磁共振仪分析T2分布的影响,发现平均T2随pH值升高而增加。

8 不同氧化条件对肌肉结构变化的影响


由图9可知,相对于被氧化组,未氧化的肌肉肌纤维排列紧密有序,且间隙相对较小;10 mmol/L H2O2(图9B、E)和60 mmol/L H2O2(图9C、F)处理组肌肉样品的肌细胞间隙明显增加,可能是因为肌纤维蛋白发生氧化导致骨架蛋白的主链断裂,从而破坏肌肉微观结构,增加肌细胞间隙。此外,肌肉在pH 8.0条件下(图9D~F)氧化时肌细胞间隙相对于pH 5.0(图9A~C)明显减小;而肌细胞间隙变大会导致缝隙中持有的水分流出,从而导致肌肉中水分损失;这与pH 8.0时肌肉离心损失相对较小的结果一致。

结 论

随Fenton氧化体系H2O2浓度的增加,牦牛肉中丙二醛、羰基含量整体呈增加趋势,总巯基含量下降,氧化程度不断加深。pH 8.0时肉中丙二醛和总巯基含量低于pH 5.0。通过SDS-PAGE分析显示,肌原纤维蛋白在发生主链氧化断裂的同时还发生了以二硫键形式及非二硫键形式的共价交联,而肌肉中的水分主要分布在肌丝间和肌原纤维间,蛋白发生共价交联,导致肌纤维之间的间距减小,肌肉持水能力降低,表现为离心损失和蒸煮损失的增加。通过低场核磁共振观察肌肉的T2分布图可知,随氧化程度增加肌肉中不易流动水含量减少,自由水含量增加,自由水存在于肌细胞外间隙中,容易在肉制品加工等过程中损失。SEM观察到肌肉的微观结构遭到一定程度的破坏,这使得肌肉在加工过程中极易由于蒸煮、剪切、挤压等操作丢失水分,进一步说明深度氧化的肌肉持水能力降低。此外,发现pH 5.0时离心损失、蒸煮损失和自由水含量相对较高,表现为pH 8.0时肌肉的持水能力相对较高,可能是因为蛋白带净电荷增加排斥力使其肌肉结构之间的空间增加,因此容纳更多水分,从而提高肌肉的持水能力。

本文《低盐环境下蛋白质氧化对牦牛肌肉结构及持水性的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第10期38页,作者:胡婷,屈莎,唐善虎,李思宁,郝刚。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220919-171。