食品界

合肥工业大学徐宝才教授等：发酵肉制品中微生物替代亚硝酸盐发色作用机理及应用研究进展

传统发酵肉制品使用亚硝酸盐作为腌制剂，亚硝酸盐可以促进肉类形成粉红色的明亮色泽，同时抑制许多腐败菌、病原菌的生长。然而，硝酸盐/亚硝酸盐通常被认定为是致癌物N-亚硝胺的前体物，因此其添加量受到严格管控。微生物发酵替代亚硝酸盐腌制剂是当前主流的研究趋势之一。自然界中有许多微生物都具备优秀的发色能力以及良好的抑菌能力，且可以产生特殊的发酵肉风味。

合肥工业大学食品与生物工程学院的孔令杰、邓洁莹、徐宝才*等详细介绍了发酵肉制品颜色转换机理，综述了近年来微生物发色作用相关研究进展，列举了微生物发色中5 种关键酶的重要作用以及两大类用于制作发酵肉制品的优势菌株。

1 亚硝酸盐应用及危害

添加硝酸盐和亚硝酸盐可以带来特有的腌制风味，为腌制肉品提供了优良的色泽。更为重要的是，亚硝酸盐可以很好地抑制肉毒梭状芽孢杆菌生长，大大降低肉毒杆菌致病率。然而摄入的亚硝酸盐在酸性条件下会与体内的生物胺结合形成致癌的亚硝酰胺，同时过量的亚硝酸盐作为一种强氧化剂会将亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白从而失去载氧能力，引发剧烈的不良反应甚至致死。亚硝酸盐带来的急性和慢性毒性不容忽视，寻找到其替代品的工作显得尤为重要。

2 肉色转换机理

肉制品颜色的转换是肌红蛋白氧化还原形式变化导致的，按照血红素中金属离子种类不同可将腌制肉制品中肌红蛋白色素分为铁卟啉肌红蛋白和锌卟啉肌红蛋白。

2.1 铁卟啉肌红蛋白

鲜肉和肉制品的色泽改变实际上是肉中的天然色素（肌红蛋白、血红蛋白）在一系列加工贮运过程中发生变化引起的。其中占比大的肌红蛋白在不同的环境条件下会转变为不同的氧化还原形式，包括鲜红色的氧合肌红蛋白、紫红色的脱氧肌红蛋白、红褐色的高铁肌红蛋白等。肌红蛋白包含由153 个氨基酸残基组成的一条多肽链和一个血红素辅基，其中血红素是铁卟啉化合物，铁离子位于卟啉环中央并通过配位键与周围的4 个氮原子相连，另外2 个配位键与组氨酸、氧或其他基团结合。刚屠宰的鲜肉中富含紫红色的脱氧肌红蛋白，接触氧气后逐渐氧化为鲜红色的氧合肌红蛋白，随着贮藏时间延长，2价铁离子被氧化为3价铁离子从而形成红褐色高铁肌红蛋白，肉制品色泽与高铁肌红蛋白的累积程度相关，当高铁肌红蛋白在总肌红蛋白中的比例低于20%时肉品仍呈鲜红色，30%～50%时颜色逐渐加深，达到70%时显褐色。当中心铁离子的第6个配位键与CO结合时会形成亮红色的一氧化碳肌红蛋白，与NO结合会形成粉红色亚硝基肌红蛋白。氧合肌红蛋白中亚铁离子第6配位与氧的结合是可逆的，例如高铁肌红蛋白还原酶通过线粒体电子呼吸链向高铁肌红蛋白提供电子使其还原为氧合肌红蛋白。

2.2 锌卟啉肌红蛋白

帕尔玛火腿是一种产自意大利北部且只使用猪腿和海盐腌制而成的干腌火腿，在不添加亚硝酸盐的情况下能产生稳定的鲜红色色素，这种色素被鉴定为锌原卟啉IX，它是二价锌与原卟啉IX配位，即二价锌取代肌红蛋白中的二价铁形成的一种特殊肌红蛋白，锌卟啉色素的形成会受到硝酸盐/亚硝酸盐还原产生的NO抑制。铁螯合酶（FECH）是锌卟啉形成过程中的关键酶，它能催化亚铁离子插入原卟啉IX形成原血红素，同时也能在体外催化血红素除铁反应得到原卟啉（血红素前体），当其与NADH-细胞色素b5还原酶联合时可以将铁卟啉转变为锌卟啉。当FECH与肌红蛋白在抗坏血酸钠和半胱氨酸存在下反应时，肌红蛋白血红素会有效地转化为锌卟啉。微生物参与的发酵肉制品中锌卟啉形成原理如图1所示。

3 微生物发色机理

微生物的发色能力主要来源于酶，目前已知形成肌红蛋白色素的关键酶包括硝酸盐还原酶（NAR）、亚硝酸盐还原酶（NIR）、一氧化氮合酶（NOS）、钼酶和FECH。

3.1 硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶

发酵肉制品中NO与肌红蛋白结合会产生粉红色的亚硝基肌红蛋白，这是一种稳定的色素，NO的形成与微生物中的3 种酶紧密相关，包括NAR、NIR和NOS。腌制肉中添加的硝酸盐腌制剂在NAR和NIR的顺序还原作用下会得到NO，而且NOS可以将L-精氨酸内源合成NO，并与肌红蛋白结合形成亚硝基肌红蛋白，该过程的原理如图2所示。

NAR以一种非常复杂的方式调控亚硝酸盐的生成，其催化两个电子从NADPH转移到硝酸盐生成亚硝酸盐，同时也可以催化一个电子从NADPH转移到亚硝酸盐生成NO，即NAR可以同时还原硝酸盐和亚硝酸盐。研究表明许多菌株如乳酸菌、葡萄球菌和大肠杆菌（Eschrichia coli）等均同时具有NAR活性和NIR活性。然而不同的菌株之间由于各种生理因素存在较大的差异导致氮源转化代谢方式不尽相同，例如对氧气的需求不同、各类酶活性不同、生长速率不同等。已有研究表明硝酸盐对NAR和NIR活性具有调控作用，由于细胞还原硝酸盐，新产生的亚硝酸盐也可能起到调控反应的作用。这两项调控作用都确保最有效地利用末端电子受体。

3.2 一氧化氮合酶

NOS催化下，L-精氨酸在有氧条件下通过两步氧化反应生成L-瓜氨酸和NO，该过程需要3 个外源电子（两个用于第1阶段，一个用于第2阶段）以及1 个血红素和1 个还原喋呤辅因子（四氢生物喋呤H4B和四氢叶酸H4F）。然而有部分研究发现细菌NOS途径形成亚硝基肌红蛋白的潜力是有限的。这可能是由于细菌中L-精氨酸参与细胞内多种反应，可以被精氨酸酶、精氨酸脱亚胺酶和NOS在内的多种酶催化，被用于NOS途径的L-精氨酸非常有限。

L-精氨酸、L-赖氨酸和其他外源氨基酸在改善肉制品的风味、抑制脂肪氧化、改善肉制品质地和加强乳化稳定性方面有着积极的作用。肉制品的颜色劣变主要是由于肌红蛋白血红素的氧化，同时脂肪和蛋白氧化过程中会产生大量的自由基会进一步加快肌红蛋白的氧化。添加氨基酸可以抑制氧合肌红蛋白的多酚辅助型氧化，加上其有效的自由基清除能力，从而可改善发酵肉制品色泽，达到护色的功能。

3.3 钼酶

钼是一种人体和动植物必需的微量元素，钼元素的氧化还原状态极易改变，是催化碳、氮、硫代谢的重要氧化还原反应酶活性部位的一部分。目前，已知的含钼酶有50多种，绝大多数钼酶存在于在原核生物之中，在真核生物中发现的钼酶数量有限。根据钼原子配位体和喋呤骨架修饰的不同，钼酶可分为黄嘌呤氧化酶（XO）家族、亚硫酸盐氧化酶（SO）家族和二甲基亚砜还原酶（DMSOR）家族。这些酶需要复杂的含钼辅助因子才能充分发挥活性，这些辅助因子在折叠后被插入到脱辅酶中。NO是一种参与多种生理过程的信号分子，NO合成的两条经典途径包括硝酸盐/NIR作用下的硝酸盐次序还原途径（缺氧）以及NOS作用下的L-精氨酸合成途径（好氧），而含有钼元素的“非专一性NIR”提供了一条NO合成新途径。

核生物还原硝酸盐通过3 种不同类型的NAR：呼吸膜结合的NAR、质周NAR、细胞质同化NAR。虽然这3 种不同类型的NAR催化相同的反应，并且活性中心钼原子均与来自两个吡喃喋呤辅因子的4 个硫原子进行配位，但这3 种NAR在钼配位球体其余部分的结构显示出显著差异。所有原核生物的NAR都是钼酶，属于DMSOR家族，在其钼中心催化硝酸盐还原为亚硝酸盐。当硝酸盐浓度降低和亚硝酸盐积累时会促进亚硝酸盐的还原，因此在硝酸盐限制的生长条件下，如果硝酸盐和亚硝酸盐都处于低浓度时，呼吸膜结合的NAR表达受到抑制，NO的合成量非常低。目前，亚硝酸盐依赖型非呼吸性NO的主要来源被认为是含钼的呼吸性NAR，研究表明大部分NO是由呼吸膜结合的NAR形成的，少量（不到3%）来自质周NAR。

3.4 铁螯合酶

FECH是所有细胞中血红素生物合成途径的终端酶，它催化亚铁插入原卟啉IX，生成血红素。FECH催化的反应包括金属底物与酶结合、卟啉环与酶结合、卟啉环扭曲、金属配体交换和血红素释放。FECH首先促进卟啉环扭曲，随后促进氮孤对电子暴露于进入的金属离子并完成金属离子的插入。FECH参与锌卟啉肌红蛋白的生成，这是一种腌制肉制品中的稳定红色色素，这种脱离硝酸盐而产生的蛋白色素具备替代食品添加剂亚硝酸盐的潜力。已有研究表明厚壁菌门和放线菌门的细菌（枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌）利用“共卟啉依赖”途径将亚铁离子插入卟啉环中。

4 微生物应用于肉制品替代亚硝酸盐发色研究进展

随着研究的加深，人们逐渐意识到微生物在腌制食品中的重要作用。随后的研究逐渐发现乳酸菌、凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative Staphylococci，CNS）是适合发酵的优势菌群（表1），因为发酵肉制品的色泽、风味、口感与腌制发酵过程中的理化性质和生物反应密切相关。

4.1 乳酸菌

乳酸菌是一种系统发育不尽相同但功能相似的细菌群，包括乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属，它们是低GC碱基含量、革兰氏阳性、兼性厌氧、无芽孢的细菌，可以发酵葡萄糖或乳糖产生大量的乳酸，使pH值降低，促进腌制剂亚硝酸盐分解，产生NO，与肌红蛋白结合形成亚硝基肌红蛋白，并且有利于蛋白质凝结增强产品质地，当pH值接近蛋白质等电点时有助于成熟。对病原菌和腐败菌的抑制是乳酸以及乙酸、甲酸、乙醇、铵、脂肪酸、过氧化氢、乙醛、抗生素和细菌素积累的结果。

4.2 凝固酶阴性葡萄球菌

CNS被证实具有芳香性质和着色能力，普遍具有较高NAR活性，凝固酶阴性微生物群主要由木糖葡萄球菌（S. xylosus）、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus）和拟葡萄球菌（Staphylococcus simulans）组成，其中优势菌种为木糖葡萄球菌（S. xylosus），建立特定的CNS群落对发酵肉制品的颜色形成十分重要，特别是在没有CNS作为起始培养物添加的情况下。一些CNS可被用作固有发酵剂来与金黄色葡萄球菌竞争。

5 结语

本文综述了近20 年来发酵肉制品中微生物替代亚硝酸盐的研究工作。从菌种方面，乳酸菌和葡萄球菌以其优良的发色性能成为了发酵菌种主力军。其中乳酸杆菌和乳酸链球菌均表现优良，常见的发酵菌种包括清酒乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、发酵乳杆菌、明串珠菌和乳酸链球菌等。常见的葡萄球菌则有木糖葡萄球菌、肉质葡萄球菌和腐生葡萄球菌。它们在不同种类的发酵肉制品中由于肉制品工艺条件差异会占据不同的比例。从发色机理方面，发酵肉制品的特有色素有两种，一种是以铁卟啉形式存在的亚硝基肌红蛋白，另一种是以锌卟啉形式存在的锌卟啉肌红蛋白。前者是NO与肌红蛋白铁卟啉中铁离子的第6配位结合而形成的，目前已知发酵肉制品中NO来源有以下两条途径：1）硝酸盐/亚硝酸盐还原，2）NOS催化L-精氨酸合成。后者是FECH作用下的锌离子取代血红素中铁离子形成的。为了替代肉制品中的硝酸盐/亚硝酸盐添加剂，微生物菌种作为发酵剂时不仅具备良好的发色能力和发酵特性，同时也具备优良的抑菌能力，乳酸菌发酵产生的乳酸、乙酸、细菌素等能够很好的抑制病原微生物，在发酵过程中菌种之间的竞争也可以使得病原菌生长沦为劣势从而在数量上逐渐减少。未来对于发酵微生物的研究应该着力于筛选新菌株，探究其发色途径，通过添加绿色健康的促进剂如氨基酸、抗坏血酸或采用基因调控等手段增强其发色能力，不断发掘微生物发酵剂替代亚硝酸盐发色的潜力。

本文《发酵肉制品中微生物替代亚硝酸盐发色作用机理及应用研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷第11期301-308页，作者：孔令杰，邓洁莹，吴莹，葛金霞，徐宝才*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220415-189。