规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）主要元件Cas9蛋白一般采用大肠杆菌表达，但在表达纯化过程中易出现形成包涵体形式的不溶解性蛋白，内毒素含量高、蛋白过大导致蛋白折叠不正确、产量低等问题。
为实现化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9蛋白（SpCas9）在大肠杆菌中的高效可溶表达，进一步促进其应用及编辑技术的推广，华南理工大学生物科学与工程学院的廖清、郑俊威、潘 力*等人将10×His标签和GB1以及SpCas9蛋白进行连接，并使用串联多个启动子的方法提高Cas9蛋白的表达。纯化的SpCas9融合蛋白在不去除标签的情况下仍然具有高可溶性和活性，避免了去除标签的操作繁琐性及标签不易切除导致的低回收率。本研究可显著提高SpCas9蛋白表达量，为大肠杆菌高效表达蛋白提供一种策略，为RNP复合物的递送形式提供便利，有利于食品级DNA-free形式的菌株育种。
1 GB1促溶标签对SpCas9蛋白表达量及溶解性的影响
将pET28a（＋）-His-SpCas9、pET28a（＋）-His-NGB1-SpCas9、pET28a（＋）-SpCas9-CGB1-His表达载体转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行诱导表达，并定量进行表达量分析。SpCas9、NGB1-SpCas9和SpCas9-CGB1蛋白均在上清液中高表达（图4），蛋白表达量水平之间的关系是SpCas9-CGB1＞NGB1-SpCas9＞SpCas9。值得注意的是，SpCas9-CGB1比NGB1-SpCas9和SpCas9的可溶性好。通过使用Image J软件对蛋白胶进行灰度比较，发现SpCas9-CGB1蛋白表达量为未融合GB1的SpCas9蛋白表达量的1.68 倍，而NGB1-SpCas9表达量仅为未融合GB1的SpCas9蛋白表达量的1.16 倍。通过对上清样进行灰度分析，可以发现，SpCas9-CGB1蛋白在上清液中表达量为全液的1.11 倍，而NGB1-SpCas9蛋白在上清液中表达量为全液的1.03 倍，SpCas9蛋白在上清液中表达量为全液的1.07 倍，因此在提高蛋白可溶性表达方面，GB1在目的蛋白C端也是更优的选择。
2.1 多重启动子对NGB1-SpCas9蛋白表达量的影响
在大肠杆菌中，使用多个启动子串联可以增加蛋白表达。如图5所示，将T7启动子串联在NGB1-SpCas9蛋白的前面，分别得到1、2、3、4 重T7启动子驱动的表达质粒。然后分别在大肠杆菌Rosetta（DE3）中通过IPTG诱导1、2、3、4 重T7启动子驱动NGB1-SpCas9表达质粒的表达，并通过灰度分析进行表达量的比较。如图5所示，多重启动子对于蛋白的可溶性无较大影响，1、2、3、4 重启动子驱动的NGB1-SpCas9蛋白均在上清液中高表达。值得注意的是，随着启动子个数的增加，目的蛋白表达量也在随之增加，4 重启动子驱动下表达量为1 重T7启动子驱动下NGB1-SpCas9蛋白表达量的1.82 倍，3 重启动子驱动下表达量为1 重T7启动子驱动下NGB1-SpCas9蛋白表达量的1.66 倍，2 重启动子驱动下表达量为1 重T7启动子驱动下NGB1-SpCas9蛋白表达量的1.23 倍。3、4 重T7启动子串联在大肠杆菌表达中对NGB1-SpCas9蛋白表达有明显促进作用。2.2 3重T7启动子促进SpCas9-CGB1蛋白表达量 在上述实验结果表明GB1促溶标签连接在SpCas9蛋白的C端时可以提高SpCas9蛋白表达量及溶解度。同时，在大肠杆菌中3、4 重T7启动子串联可以显著提升目的蛋白表达量。因此，将这两种策略进行组合旨在进一步提高SpCas9目的蛋白表达量。通过在大肠杆菌中进行pET28a（＋）-SpCas9-CGB1-His-3T7表达载体的IPTG诱导表达，发现3 重启动子策略确实提高了SpCas9-CGB1蛋白表达量，3 重T7启动子驱动下表达量为1 重T7启动子驱动下SpCas9-CGB1蛋白表达量的1.50 倍，且对SpCas9-CGB1蛋白的溶解度无影响，SpCas9-CGB1蛋白大部分存在于上清液中。这两种策略的组合在一定程度上解决了SpCas9蛋白在大肠杆菌中表达量较低的问题，表达量较原始菌株总的提高了2.52 倍（图6）。 考虑到10×His标签对Ni2＋的高亲和力，将粗蛋白裂解液与Ni-NTA树脂孵育后，用含500 mmol/L咪唑的缓冲液B及未含咪唑的缓冲液A按照梯度依次洗涤树脂，见峰收样，通过SDS-PAGE进行纯化收集液分析，SpCas9-CGB1蛋白大小为165 kDa，结果如图7所示。SpCas9-CGB1蛋白的10×His标签与Ni2＋柱Ni-NTA材料结合能力较弱，在梯度洗脱过程中，在20%、30%、50% Buffer B的洗脱梯度均有目的蛋白存在。其中大部分目的蛋白主要分布在20%洗脱峰样品中，30%其次，50%的洗脱峰中目的蛋白则较少。其中20%洗脱峰中杂蛋白较多，30%、50%洗脱峰中基本无杂蛋白。将Ni2＋亲和层析柱纯化后的融合蛋白SpCas9-CGB1溶液通过超滤（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，3 mmol/L二硫苏糖醇，pH 8.0）置换溶液除去咪唑及杂蛋白，即获得目的蛋白。将浓缩后的SpCas9-CGB1蛋白保存在50%甘油中。 
根据SpCas9蛋白在体外也具有功能活性，可以在sgRNA引导下结合到正确位置对DNA双链进行切割造成DNA双链断裂，选用米曲霉的NiaD位点为目的序列进行体外切割验证。通过T7体外转录进行设计sgRNA合成，并进行体外切割所需模板的PCR扩增及片段回收。通过使用市售SpCas9蛋白作为阳性对照组，纯化SpCas9-CGB1蛋白作为实验组，及使用未加SpCas9蛋白作为阴性对照组，进而验证纯化SpCas9蛋白是否具有正确的切割活性。如图8所示，纯化浓缩后SpCas9-CGB1蛋白在不去除GB1标签情况下具有正确的功能活性，可以与市售SpCas9蛋白在同样的切割位置产生切割。 
根据SpCas9蛋白与sgRNA预组装的RNP复合物可以在宿主体内进行功能行驶，对目的基因进行靶向编辑切割，造成DNA双链断裂激活宿主体内的修复机制。进行SpCas9-CGB1蛋白体内功能活性功能验证。通过将纯化得到SpCas9-CGB1蛋白与体外合成的sgRNA进行孵育后进行黑曲霉CBS 513.88菌株的转化，靶向基因为pyrG，转化流程如图9所示。设置阳性板、阴性板及转化板。其中，阳性板为未加RNP复合物和筛选物质（5-FOA和U），阴性板为未加RNP复合物但加筛选物质（5-FOA和U），转化板为加RNP复合物和筛选物质（5-FOA和U）。结果阳性板长出菌落、阴性板未长出菌落、转化板有菌落长出。挑取转化子于板上，进行表型验证。如图10A所示，转化子均较野生菌有明显的表型差异。将多个转化子接入24 孔板进行培养，后提基因组进行PCR扩增pyrG基因。经测序鉴定得到在pyrG在sgRNA位置产生了缺失，如图10B所示。可看出SpCas9-CGB1有入核进行基因编辑的能力。
CRISPR系统已经成为目前主流的基因编辑技术，其中RNP复合物的递送形式趋于流行。对于RNP复合物的递送形式来说，首先需要获得Cas9蛋白。SpCas9蛋白来源于细菌，因此更适用于大肠杆菌等原核表达系统。目前，SpCas9蛋白大都选用大肠杆菌表达。本研究通过使用GB1促溶标签及多重启动子策略实现了在大肠杆菌中SpCas9蛋白的高效可溶性表达，在一定程度上解决了产量低的问题。总的来说，GB1促溶标签的使用使得目的蛋白表达量提高了1.68 倍，且得到的SpCas9-CGB1蛋白在上清液中表达量为全液的1.11 倍，提高了溶解度。通过将SpCas9-CGB1的形式与3 重T7启动子策略进行组合，进一步提高了目的蛋白表达量，较1 重T7启动子驱动下SpCas9-CGB1蛋白表达量提高了1.50 倍。
本研究使用的GB1促溶标签对SpCas9蛋白功能活性无影响。通过体外酶切活性验证，SpCas9-CGB1蛋白与市售SpCas9蛋白功能活性一致。
对于许多丝状真菌的基因编辑，大多是通过含有SpCas9基因编码框的质粒进行。而质粒的递送形式会引入外源DNA，且SpCas9蛋白在宿主中的表达会消耗宿主的营养物质及能量，积累的Cas9蛋白较强毒性会妨碍宿主菌的正常生长甚至导致宿主死亡。目前已经开发了针对丝状真菌的RNP复合物转化方法。通过黑曲霉体内RNP复合物转化实验，表明SpCas9-CGB1蛋白的RNP复合物可以对黑曲霉pyrG基因进行切割断裂，致使宿主的非同源末端修复机制启动，在切割处引入插入或缺失，破坏基因编码框。综合体内和体外应用，表明SpCas9-CGB1蛋白具有正确功能活性，即GB1促溶标签对于SpCas9蛋白功能活性无影响，不用切除，提高了实验操作的简便性，在一定程度上解决了去标签难这一问题。但是SpCas9-CGB1蛋白的10×His标签与Ni2＋柱Ni-NTA材料的结合能力较弱，在梯度洗脱过程中，在20% Buffer B洗脱梯度样品中有较多目蛋白存在，且含有杂蛋白较多。而鲍玲娜等在大肠杆菌中进行的SpCas9蛋白表达及纯化中，先使用了硫酸铵沉淀再通过Ni2＋柱亲和层析进行蛋白纯化，获得了较纯的SpCas9蛋白。因此，未来可以参考此方法对SpCas9-CGB1蛋白进行纯化，从而提高其纯化效率。 综合来说，本研究通过使用GB1促溶标签及多重启动子，实现了SpCas9蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，并成功在曲霉中通过基于RNP复合物基因组编辑，证明了SpCas9-CGB1蛋白的正确功能活性。
本文《SpCas9蛋白的高效可溶表达及应用》来源于《食品科学》2023年44卷10期第150-157页，作者：廖清，郑俊威，王斌等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220429-391。
