大肠埃希氏菌（Escherichia coli）简称大肠杆菌，能发酵葡萄糖、乳糖和麦芽糖等并产酸产气，广泛存在于自然界和动物肠道中。其中，产志贺氏毒素大肠杆菌（STEC）是近年来发现的严重威胁公共卫生安全的食源性致病菌。大肠埃希氏菌中某些特定的血清型能够引发人类严重的疾病。这些致病性大肠埃希氏菌广泛存在于初级农产品中，其在食品加工过程中会遇到各种环境胁迫，研究表明大肠埃希氏菌在弱酸环境中适应一段时间后再处于强酸环境时存活能力增强，同时其耐热、耐低温、耐渗透压以及抗生素的能力也可能增强，这对食品安全造成了极大威胁。
山东农业大学食品科学与工程学院韩吉娜，罗欣，董鹏程*等人对大肠埃希氏菌的诱导耐酸响应、双组分调控系统、pH值稳态系统、细胞膜流动性调节、大分子的保护和修复及其交叉保护现象等方面的研究进展进行概述，并提出今后可能的研究方向，以期为深入了解大肠埃希氏菌在食品加工过程中的胁迫响应并为日后提出更为有效的防控措施提供理论指导。
在相当长的一段时间内，大肠杆菌被认为是对人类无害的，随着生鲜牛肉消费量的增加，由致泻大肠杆菌引发的疾病越来越多。目前常见的致泻大肠杆菌主要有5 类，分别是肠道致病性大肠杆菌、肠道侵袭性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、STEC（包括肠道出血性大肠杆菌）和肠道集聚性大肠杆菌。除了大肠杆菌O157:H7这一典型的血清型外，越来越多的血清型也被发现。其中，O145、O121、O111、O103、O45和O26被称为“Top Six”血清型，对公共卫生安全具有潜在威胁。
诱导耐酸响应（ATR）是指微生物在亚致死酸性环境中培养一段时间后（酸适应），其抵抗致死性酸环境（酸激）的能力得到提高的一种现象。ATR不仅仅存在于大肠杆菌中，还广泛存在于沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌等食源性致病菌中。ATR不仅受菌株因素影响，还受外部环境因素（酸适应pH值、酸适应时间、培养温度、酸激pH值、酸激时间、培养基成分等）的影响。其中，大肠杆菌的ATR可通过暴露于弱酸环境下（pH 4.5～5.8）诱导，保护细胞免受极端酸性pH值（pH 2.0～3.0）的攻击；对数期与稳定期均可激活ATR，但是相比于对数期，稳定期的大肠杆菌更耐酸。但其具体的作用机制尚不完全明确，因此，深入探究大肠杆菌ATR的形成机理有助于更好地理解不同因素对ATR形成的影响及其控制措施，对于保障食品安全具有重要意义。 大肠杆菌的ATR有多种产生机制，主要包括酸信号的传导、胞内pH值稳态的维持、细胞膜完整性和流动性调节、大分子的保护和修复等，这些机制对保障大肠杆菌在酸性环境下的生存和代谢至关重要。
双组分调控系统是细菌感知外界的环境信号并将其传导至菌体内部，从而激发一系列调控机制的重要途径，也是影响大肠杆菌耐酸能力的重要因素之一。系统由组氨酸蛋白激酶（HK）和反应调控蛋白（RR）构成，前者感知信号，后者用于调节DNA转录（图2）。大肠杆菌O157:H7 ATR的产生涉及复杂的信号感应及反应过程，PhoP/PhoQ与EvgS/EvgA双组分调控系统便是其中一类跨膜信号传导机制。经过微酸诱导后，细菌的PhoP/PhoQ等组分系统的蛋白表达量可发生上调，当PhoP/PhoQ缺失后，菌株的耐酸能力降低，且由其调控的多种酸激蛋白合成受到阻碍。PhoP蛋白磷酸化可激活pmrD、ompR基因的表达，从而进一步激活PmrA/PmrB（调控毒性、抗氧化等生理活动）等信号感应系统，引起下游基因群表达的改变。除耐酸性外，PhoP/PhoQ还可调节参与Mg2＋转运、毒力以及某些胁迫条件下脂多糖修饰的基因。由此可见，双组分调控系统的感应蛋白不仅可以感应胞外的H＋信号，还可以感应胞内pH值的变化，并将此信号传导至细胞内部进而做出相应调控。
EvgS/EvgA可以与PhoP/PhoQ发挥协同作用，它不仅可以激活下游的ydeO基因与gadE基因，从而间接调控谷氨酸脱羧酶系统，还可以通过PhoP/PhoQ系统的组氨酸激酶PhoQ进而调控蛋白PhoP对H＋做出调控；还有学者提出EvgS/EvgA可将信号传导至PhoP/PhoQ，再通过下游调控蛋白RssB防止RpoS蛋白发生降解，从而提高大肠杆菌在酸性环境中的存活率。 CpxR/CpxA双组分调控系统则是对数生长期大肠杆菌对抗酸胁迫的关键系统。在pH为4.0～5.0的酸性环境下，CpxR/CpxA通过CpxA周质组氨酸残基的质子化直接感受酸信号，并上调fabA和fabB基因，从而促进不饱和脂肪酸的产生。脂质组成的变化降低了膜的流动性，降低了F0F1-ATP酶的活性，并改善了细胞内pH值稳态（图3）。外膜蛋白NlpE的过表达被确定为Cpx的特异性激活信号，能够显著提高fabA和fabB的表达水平以及大肠杆菌在pH 4.2时的耐酸性，cpxR缺失后则完全消除了NlpE的这种激活作用。同时有研究表明，PhoP/PhoQ、CpxA/CpxR以及PmrA/PmrB等双组分调控系统还与细菌的耐药性密切相关，且有一些组分系统还可以激活与生物膜形成相关基因的表达。 综上，双组分调控系统涉及复杂的调控网络，它不仅能够通过组分系统之间的信号蛋白将感应的信号传递到其他双组分系统中，还可以间接调控氨基酸代谢等途径，而其最初是如何感应环境信号，及其具体的调控路径和彼此之间的联系尚不完全明确，有待进一步探索。考虑到双组分调控系统在细菌生理方面发挥的重要作用以及在细菌中的保守性和在哺乳动物细胞中的缺失，该系统也是开发和优化抗菌措施的重要潜在靶点，更好地描述这些系统的基因和功能是将双组分调控系统作为治疗靶点的关键。 到目前为止，已有多个大肠杆菌的耐酸反应系统被报道，见表1。
1） 葡萄糖-阻碍耐酸系统（AR1）
AR1系统是研究人员将大肠杆菌在pH 5.5的培养基中培养至稳定期，再将其置于pH 2.5环境中发现大肠杆菌仍能存活而发现的。该系统由选择性信号因子σs（RpoS）和总调控蛋白环腺苷酸受体蛋白（cAMP receptor protein，CRP）（一种调控因子）激活。由于CRP的参与，AR1系统会受到葡萄糖的抑制。而RpoS是大肠杆菌面对酸胁迫以及各种环境胁迫时的重要调控因子，它活跃在许多稳定期的革兰氏阴性菌中。酸性环境可以直接作用RpoS，诱导RpoS的翻译、抑制RpoS的降解，从而增加RpoS的含量。尽管AR1是第一个被描述的耐酸系统，高度依赖于σs，然而，目前关于AR1的结构组分和保护机制仍不完全明确。 AR2系统是迄今为止最有效、最复杂的耐酸系统。该系统依赖于两个谷氨酸脱羧酶（GadA和GadB）的异构体、GABA和反转运蛋白GadC，并在谷氨酸存在时发挥作用。当细菌暴露于低pH值环境中时，细胞外的谷氨酸分子通过GadC输入细胞，催化形成GABA后从细胞中排出（图3）。这个过程消耗细胞内质子，提高胞内pH值来响应酸胁迫，从而维持pH值稳态。AR2系统的调节与20多种蛋白质和3 种非编码小RNA有关，连同EvgA/EvgS和PhoP/PhoQ双组分调控系统以及RpoS、GadE、GadX、GadW等调节蛋白共同构成了一个高度复杂的调控网络。其中GadE是主要调节因子之一，gadE基因缺失后的大肠杆菌O157:H7对酸更加敏感。该系统在不同的细菌中存在差异，在沙门氏菌中鲜见报道。 与AR2类似，只有当精氨酸存在于细胞外时，AR3才能发挥作用。精氨酸通过反转运体AdiC进入细胞，并在精氨酸脱羧酶AdiA的催化作用下转化为胍丁胺，在此过程中消耗细胞内质子并释放二氧化碳（图3）。AR3受CysB、RpoA、CRP、AdiY、H-NS和IHF等调节因子的影响。在pH值为2.5的酸胁迫下，AR3比AR2能够提供更强的保护作用。在极端酸胁迫时，精氨酸以羧基质子化形式（Arg2＋）存在，与精氨酸相比，Arg2＋不被AdiC优先转运到细胞质中，因此精氨酸的存在形式影响其耐酸作用的发挥。且据报道，只有AR2和AR3耐酸系统可以在对数期发挥作用。
在AR4耐酸系统中，谷氨酰胺（Gln）也可以通过GadC进入细胞质，并通过谷氨酰胺酶YbaS转化为谷氨酸，同时释放气态氨（图3）。YbaS和GadC在pH≤6时发挥作用，游离氨也可以中和质子，维持大肠杆菌pH值稳定并提高大肠杆菌的耐酸性。
鸟氨酸和赖氨酸依赖型耐酸系统也均由反转运蛋白和脱羧酶组成，通常由酸性pH值和细胞外氨基酸诱导，然而其对耐酸的贡献较低，当外界环境的pH＜2.5时，该系统耐酸作用的发挥受到限制。
细胞膜为细胞生长和代谢提供了稳定的细胞内环境。极低的pH值通常会导致细胞形态的改变，而维持适当的膜结构和功能是所有细胞代谢活动的先决条件。一些微生物通过调节脂肪酸组成来调节膜流动性，因为细胞膜的双层结构可以通过改变脂肪酸的分布来改变。不饱和与饱和、顺式与反式、支链与非支链脂肪酸的比例都与甘油磷脂的酰基链结构有关，改变不饱和度是细菌控制膜流动性的一种常见机制。此外，研究还证明经有机酸诱导后单核细胞增生李斯特菌的细胞膜脂肪酸图谱发生改变，氢离子是主导因素，与酸根离子的存在关系不大。由此可见，细胞膜流动性降低可在一定程度上提高大肠杆菌的耐酸性。 特定的蛋白质通常由酸胁迫信号诱导，以保护或修复大分子如DNA和蛋白质。伴侣蛋白是周质中的一类特殊蛋白质，能介导其他蛋白质的正确折叠与装配，其中HdeA和HdeB可在大肠杆菌处于低pH值条件下保护周质蛋白。这两种伴侣蛋白在中性pH值下是折叠良好的“无活性”二聚体，当暴露于低pH值时，它们转化为高度可塑的单体构象，以促进蛋白质重折叠或阻碍酸诱导的未折叠蛋白质的聚集。近年来，通过蛋白质组学进一步揭示了不同酸性条件下与HdeA和HdeB结合的不同蛋白质，发现大多数蛋白质都与代谢途径和膜蛋白相关。
HdeA和HdeB还可减少周质中氯化物的大量积累。存在于大肠杆菌细胞膜上的氢离子和氯离子转运蛋白（CLC H＋/Cl－）既可以消耗细胞膜内的质子降低电荷，又可将细胞内的氢离子转运至细胞外并将细胞外的氯离子等阴离子转运至细胞内，维持细胞内的负电荷。这两种伴侣蛋白的存在可以使大肠杆菌对更大范围的酸胁迫环境快速作出反应，探究在酸性条件下受HdeA和HdeB保护的蛋白功能对深入了解大肠杆菌的耐酸性也有重要意义。
此外，大肠杆菌还可以通过激活SOS反应在DNA受到损伤时做出修复。SOS是一种参与DNA修复的系统损伤诱导反应，由recA和lexA基因调节。在酸胁迫环境下，DNA受到损伤形成单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）。当细胞内的ssDNA积累时，RecA与ssDNA相结合形成复合物，LexA阻遏物结构发生改变，SOS体系高效表达，DNA得到修复。受损蛋白质和DNA的修复被微生物广泛用于抵抗酸胁迫。 为确保食品的安全性并延长其货架期，热处理是食品加工过程中灭活病原微生物和腐败微生物所采取的常用方法之一，ATR可提高大肠杆菌的耐热性。在食源性病原体中由低pH值引起的酸适应和由水分活度降低引起的高渗透压适应之间是否会产生交叉保护是一个重要的食品安全问题。将大肠杆菌置于pH 5.5的环境中进行酸适应，在面对高浓度氯化钠时产生了交叉保护。酸和盐的组合是否足以控制病原体也与氯化钠浓度有关。乙酸和盐的联合作用会呈现不同的结果，是否会产生交叉保护也与所使用的培养基成分有关。大多数细菌发生交叉保护的原因在于细菌响应一种胁迫时，会产生多种保护蛋白，修复因环境胁迫而变性的大分子物质。
随着消费者对新鲜和营养食品需求的不断增加，一些非热加工技术如紫外线、超声波、冷等离子体和高压处理等技术也不断发展。相关报道指出，经经酸适应后的大肠杆菌O157:H7对紫外灭菌的抗性显著增强，酸适应还可以增强大肠杆菌O157:H7的毒力基因表达。因此，在监测和控制环境及食品中的大肠杆菌时，应注意酸适应菌株会产生交叉保护的现象，这有利于对其进行科学有效的风险评估和控制，也对生产新型高效的食品抑菌剂和防腐剂有重要的指导意义。 ATR是细菌在压力环境下复杂的生理生化反应，主要包括信号感应以及多种代谢机制的调控，然而具体的代谢过程和调控细节有待进一步明确。尽管文献中提出了许多耐酸反应机制，但大肠杆菌交叉保护的确切机制仍然没有定论，借助同源重组和CRISPR/Cas9等基因编辑技术、染色质免疫共沉淀技术以及转录组学、蛋白质组学和代谢组学的联合分析技术发现，新的耐受基因和具体的调控通路是当前的一个研究方向。其次，目前的大多数研究是基于实验室规模来分析细菌的分子机制，针对实际生产中的研究较少，而不同的食品介质营养成分差异很大，结合实际情况具体条件具体分析，了解其关联性，对于深入明晰细菌的交叉保护分子机制也有重要意义。与此同时，食品加工过程中涉及多种胁迫因子，探究面对多种环境胁迫及联合处理对大肠杆菌的影响，有助于模拟大肠杆菌面对的真实场景，科学地阐明大肠杆菌的耐酸及交叉保护的调控机制。
本文《大肠埃希氏菌的诱导耐酸响应及其交叉保护作用机制研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷第11期214-221页，作者：韩吉娜, 罗欣, 朱立贤等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220504-037。
