山西农业大学云少君教授、冯翠萍教授等:铁蛋白-白藜芦醇包埋物的制备、表征及其抗氧化性分析

2023-09-20作者:来源:责任编辑:食品界 字体A+AA-

白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物,具有减轻炎症、抑制氧化应激、保护心血管内皮功能、缓解阿尔茨海默症引起的记忆衰退以及调节免疫等生理功能,还对肿瘤细胞具有抑制和杀伤作用。白藜芦醇水溶性低,加之其较差的稳定性导致其生物利用率较低。因此,采用乳液、纳米载体等运载体系保护白藜芦醇免受环境因素干扰可以提高其生物利用率。铁蛋白是一类天然的铁储存蛋白,普遍存在于动物、植物和微生物中(酵母除外),因其独特的纳米笼状结构已经成为一种新兴的纳米包埋材料。

山西农业大学王胜男、云少君*和冯翠萍*等人将白藜芦醇包封于重组人H链铁蛋白中,制备重组人H链铁蛋白-白藜芦醇纳米包埋物(记为rHuHF-Res),并对其理化性质进行探讨,之后经体外模拟胃肠液消化后分析其抗氧化特性。研究结果将为白藜芦醇的进一步应用提供参考。

01 rHuHF-Res的制备及表征

1)重组人H链铁蛋白制备

由图1可知,所提取蛋白的亚基分子质量约为21.0 kDa。

2)包封率分析
白藜芦醇溶于乙醇的标准曲线在浓度为0~100 µmol/L(R2=0.997)时呈良好的线性。扣除表面结合的白藜芦醇后,得到每个重组人H链铁蛋白分子可以将大约22 个白藜芦醇分子包裹在其空腔中,包封率为11.25%,载药量为1.15%。
3)透射电子显微镜结果分析

由图2可知,使用磷钨酸对重组人H链铁蛋白进行负染色后,染液通过重组人H链铁蛋白外壳的通道进入重组人H链铁蛋白内部空腔并发生沉积,因此重组人H链铁蛋白在透射电子显微镜下核心会呈现黑色的圆点状。而重组人H链铁蛋白内部空腔中包埋白藜芦醇时,蛋白质空腔被白藜芦醇占据,从而阻止染液从蛋白质外壳的通道进入蛋白质内部,使重组人H链铁蛋白呈现为白色球状。如图2a所示,单独的重组人H链铁蛋白在电子显微镜下呈现出约为12 nm的均一球形结构,且内部均有黑色的核心。当白藜芦醇与重组人H链铁蛋白成比例简单混合后(rHuHF+Res),得到的蛋白质样品(图2b)显示出与重组人H链铁蛋白相同的黑色核心,表明白藜芦醇没有扩散到重组人H链铁蛋白腔中。白藜芦醇被重组人H链铁蛋白包埋后,rHuHF-Res(图2c)在溶液中没有明显的聚集态,为白色实心球状包埋物,显示白藜芦醇被成功包埋在重组人H链铁蛋白空腔中。

4)粒径分析

由图3可知,rHuHF-Res与重组人H链铁蛋白直径都在13.5 nm附近,说明白藜芦醇包埋于重组人H链铁蛋白空腔中并未改变其粒径

02 rHuHF-Res光热稳定性分析

1)光稳定性分析
白藜芦醇是一种光敏化合物,而重组人H链铁蛋白外壳对极性环境较为稳定。由图4a可知,随着光照处理时间的延长,单独的白藜芦醇在306 nm波长处的峰值强度逐渐降低,表明白藜芦醇降解或发生异构化。与重组人H链铁蛋白进行简单混合后,少量结合的白藜芦醇在一定程度上亦存在降解现象(图4b)。纳米粒子中的白藜芦醇降解速率最低(图4c),可见重组人H链铁蛋白的笼状结构可以很好地保护被包埋的白藜芦醇。

2)热稳定性分析

由图5a可知,随着加热时间延长,白藜芦醇的吸收峰值逐渐下降;白藜芦醇与重组人H链铁蛋白简单混合后也存在一定降解(图5b)。而在rHuHF-Res纳米粒子中,白藜芦醇几乎不发生降解(图5c)。结果进一步表明,重组人H链铁蛋白外壳较好保护了白藜芦醇在加热过程中的降解或异构化。


03 rHuHF-Res相互作用分析

1)紫外-可见光谱分析
如图6a所示,重组人H链铁蛋白在280 nm波长处有最大吸收峰,白藜芦醇在306 nm波长处有最大吸收峰。rHuHF-Res在280 nm以及306 nm波长处均有较为明显的吸收峰,表明白藜芦醇在经过超声处理后包埋入重组人H链铁蛋白空腔中,与蛋白质发生了相互作用。rHuHF+Res的最大吸收峰低于rHuHF-Res,可能与结合于重组人H链铁蛋白表面的少量白藜芦醇有关。据研究报道,铁蛋白对热相对稳定,80 ℃热处理10 min仍不变性,但是铁蛋白的通道相对敏感。目前,已经发现很多铁蛋白包埋小分子的方法均是通过扩大铁蛋白通道实现。因此,本研究可能是由于超声辅助加热后,重组人H链铁蛋白的通道扩张,进而使白藜芦醇通过扩张的孔道进入到重组人H链铁蛋白空腔中。

2)傅里叶变换红外光谱分析

由图7可知,3400~2500 cm-1处吸收峰表明羧酸类(—COOH)的氢键伸缩振动,相对于重组人H链铁蛋白,rHuHF-Res在3193 cm-1处的吸收峰增强,表明重组人H链铁蛋白与白藜芦醇之间发生相互作用,产生氢键。1630 cm-1和1552 cm-1处的峰代表C=O伸缩振动,1295 cm-1和1036 cm-1处的增强吸收谱图代表—OH变形和C—O伸缩振动,rHuHF-Res包埋物在上述波数下吸收峰均增强,可见白藜芦醇的包埋影响了其结构,通过分子间氢键作用导致了上述基团的变化。1388 cm-1和1132 cm-1(C—O拉伸)处为白藜芦醇的特征吸收峰,rHuHF-Res包埋物红外光谱图中同样存在以上吸收峰,进一步说明白藜芦醇存在于重组人H链铁蛋白中,二者发生相互作用。

3)荧光光谱分析

图8表明,重组人H链铁蛋白在330 nm波长处有荧光峰,而rHuHF-Res的荧光峰发生蓝移,表明重组人H链铁蛋白与白藜芦醇之间的相互作用使得重组人H链铁蛋白四倍轴通道更加疏水。负载白藜芦醇导致重组人H链铁蛋白荧光猝灭,表明白藜芦醇可能位于Trp等发色团附近,改变了其疏水微环境。

4)圆二色谱分析

由表1可知,重组人H链铁蛋白的空腔负载白藜芦醇使α-螺旋相对含量减少,这可能是重组人H链铁蛋白表面电荷发生改变所导致。β-折叠相对含量减少和无规卷曲相对含量增加表明,包埋对蛋白质的二级结构造成了一定影响。结果进一步说明,白藜芦醇可能通过影响氢键等的形成从而影响重组人H链铁蛋白的二级结构。

04 抗氧化性分析

由图9可知,白藜芦醇在模拟胃肠液消化前,其清除超氧阴离子自由基及DPPH自由基能力均显著高于消化后(p<0.05),而rHuHF-Res在消化后的清除能力均显著高于消化前(p<0.05)。此外,rHuHF-Res包埋物在消化前的清除能力显著低于游离白藜芦醇(p<0.05),而在消化后的清除能力明显高于游离白藜芦醇(p<0.05)。白藜芦醇具有较好的抗氧化性,而游离白藜芦醇经过胃肠液消化后,抗氧化活性明显降低,可能与其发生降解或异构化有关。rHuHF-Res包埋物中,重组人H链铁蛋白空腔能够保护白藜芦醇降解,而在消化后蛋白质外壳得以打开,使其中的白藜芦醇释放,进而使自由基清除率上升。

05 结论

利用超声辅助的方式制得rHuHF-Res,其包封率为11.25%,重组人H链铁蛋白包埋白藜芦醇后并未改变其粒径,且经过表征后二者通过氢键等发生了相互作用,该纳米粒子具有较好的光热稳定性及抗氧化性,可为后期进一步开发利用提供理论支持。

本文《铁蛋白-白藜芦醇包埋物的制备、表征及其抗氧化性分析》来源于《食品科学》2023年44卷第12期34-41页,作者:王胜男,杨皓瑜,何丽霞,郭元昊,云少君*,冯翠萍*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221018-175。