宁夏大学刘敦华教授等：枸杞果实生长发育过程中寡糖代谢的蛋白组学分析
2023-09-22作者：来源：责任编辑：食品界
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枸杞（Lycium barbarum L.）为茄科枸杞属落叶灌木植物，主要分布在我国西北地区，其中富含多糖、类胡萝卜素和甜菜碱等代谢物，是传统名贵中药材。寡糖是含有2～10 个糖苷键的小分子聚合糖类，是枸杞果实中具有生物活性的主要成分之一。枸杞果实中寡糖的合成来源于单糖/二糖的聚合以及淀粉、细胞壁纤维素和多糖的降解。
宁夏大学食品与葡萄酒学院高鹏燕、刘敦华*和国家市场监管枸杞及葡萄酒质量安全重点实验室的李佩佩等分析了枸杞果实生长发育过程中寡糖含量的变化规律，在此基础上采用同位素相对标记与绝对定量（iTRAQ）技术鉴定枸杞果实发育过程中与寡糖合成代谢相关的差异蛋白，对枸杞果实生长发育过程中寡糖合成代谢机制进行探究，旨在为科学调控枸杞原材料寡糖合成积累提供理论基础，为进一步探究枸杞寡糖的代谢机理、提高枸杞果实的加工品质及获取更多的枸杞活性寡糖提供理论依据。
在不同生长时期枸杞寡糖含量通过苯酚-硫酸法测定，标准曲线方程为y=1.010 8x-0.000 4（R2=0.999 3），结果如图1所示。结果表明，枸杞寡糖含量的累积主要集中在青果期S2和黄变后期S4，在S2和S4时期寡糖含量最高，相对比于其他3 个时期有显著差异（P＜0.05），而在黄变初期S3含量最低且有显著差异（P＜0.05）。
以S1时期的枸杞果实作对照组，分别对S2～S5时期的枸杞果实进行差异蛋白鉴定，在枸杞的整个生长发育过程中，共观察到1 799 种蛋白质的丰度变化超过1.2 倍（P＜0.05）。通过iTRAQ定量蛋白组学技术，从生物过程、分子功能和细胞组成3 个方面分析在GO数据库中所筛选到的差异蛋白，进而做更准确的功能注释。 
如图2所示，通过GO功能注释，分别筛选出枸杞生长过程中5 个时期与寡糖合成代谢相关的差异蛋白共461 种。随着果实的不断发育成熟，与寡糖合成相关的蛋白质在数量和丰度均有显著变化，上调差异蛋白和下调差异蛋白数均显著增加。与S1相比，S2时期果实差异蛋白总数为31 个，其中上调表达的差异蛋白有12 个，下调表达的差异蛋白为19 个。S3共有差异蛋白总数90 个，上调表达的蛋白数和下调表达的蛋白数均为45 个。S4筛选得到差异蛋白数共有158 个，其中上调表达的差异蛋白数为78 个，下调表达的差异蛋白数为80 个。S5差异蛋白共182 个，其中上调表达的蛋白为90 个，下调表达的蛋白数为92。通过图2 Venn图可知，同时对比S2、S3、S4和S5这4 组数据，从中筛选出与枸杞寡糖相关的差异蛋白中共有12 个。随着枸杞果实不断地生长成熟，与寡糖代谢相关的差异蛋白数也逐渐增多，说明枸杞果实在生长发育过程中的寡糖代谢过程发生显著变化。 以S1时期枸杞为对照组，分别对S2～S5时期的枸杞果实进行差异蛋白鉴定，在枸杞的整个生长发育过程中，共观察到1 799 种蛋白质的丰度变化超过1.2 倍，所有P＜0.05。通过在GO数据库中所筛选到的差异蛋白，进而做更准确的功能注释。由图3A可知，主要参与的生物过程中主要包括寡糖和蔗糖、蔗糖、多糖、细胞葡聚糖等糖类的合成代谢。细胞组分中以寡糖基转移酶复合物、光系统II、糖苷复合物和叶绿体以及淀粉体为主，差异蛋白数达到73 个。
而S4时期（图3C）相比S2和S3，差异蛋白数量在生物过程、分子功能和细胞组成这3 个过程均显著增加，发现在S4时期枸杞果实是以寡糖代谢、细胞壁多糖代谢、糖胺聚糖代谢、葡聚糖代谢、细胞多糖以及淀粉代谢等生物过程为主；此阶段，糖的合成代谢减弱，枸杞中以细胞多糖、葡聚糖、淀粉和细胞壁多糖的分解为主。由图3B可知，在S3时期，参与寡糖合成代谢的生物过程主要有二糖的生物合成代谢、蔗糖合成代谢、细胞多糖代谢、麦芽糖分解代谢、寡糖合成代谢过程和细胞葡聚糖代谢过程等，参与寡糖合成代谢途径的差异蛋白数共计489 个；同时差异蛋白调控糖基转移酶活性、水解酶活性、寡糖转移酶活性和DUP-葡萄糖基转移酶活性。S3时期相比于S2时期，参与调控寡糖的差异蛋白数量显著增加，主要通过积累的细胞多糖和葡聚糖分解成寡糖，其中β-淀粉酶活性增强，通过作用于淀粉或淀粉水解物得到寡糖，同时还通过糖基化合成植物体需要的寡糖和蔗糖；细胞组成中主要有叶绿体、葡糖苷酶II复合物、β-半乳糖苷酶复合物 和高尔基体等与寡糖合成和代谢相关。 如图3D所示，在S5时期，寡糖合成代谢过程相关的生物过程中的差异蛋白数对比上一时期数量显著下降。枸杞生长过程中寡糖的代谢由多种蛋白质的协同作用，其中包括参与葡萄糖和果糖代谢的己糖激酶和果糖激酶，参与蔗糖代谢的蔗糖转运蛋白、液泡葡萄糖转运蛋白、蔗糖磷酸合酶、液泡膜单糖转运蛋白和蔗糖合酶和转化酶，说明寡糖的合成代谢是一个复杂动态变化的过程。 依据GO富集结果共找到参与寡糖合成代谢相关的蛋白，除去未表征的蛋白共有133 个，枸杞生长过程中与寡糖代谢相关的不同时期差异蛋白的相对表达。 在枸杞果实生长成熟过程中寡糖的合成代谢途径中，通过分析差异蛋白发现其主要参与果糖和甘露糖代谢、淀粉代谢途径、蔗糖和淀粉转化途径、细胞壁多糖合成代谢、多糖合成代谢等调控，说明枸杞寡糖代谢相关差异蛋白主要通过参与碳水化合物代谢途径，调节果实中糖的总体稳态；糖来源于叶片的光合作用，经历了一系列生理步骤并在果实中产生大量积累，解释了枸杞寡糖在S1、S2和S3三个生长时期增多；其中在S1对比组筛选出22 个差异蛋白，主要参与蔗糖和淀粉代谢途径的酸转化酶以及β-淀粉酶和蔗糖合成酶，说明在青果时期的枸杞果实主要通过光合作用合成糖类，其中大部分主要是以淀粉的形式进行储存，少部分是以β-淀粉酶和α-淀粉酶等淀粉水解酶在淀粉和蔗糖转化途径中分解为蔗糖，从而实现蔗糖的积累；同时在蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶的作用下，蔗糖进一步分解，为果实生长发育提供能量，此过程使寡糖少量积累。在S2时期共筛选出60 个差异蛋白，结果表明在糖酵解过程中的果糖二磷酸醛缩酶和磷酸甘油酸激酶在黄变初期呈现上调，其他参与糖醛酸代谢和葡萄糖醛酸代谢过程的醛脱氢酶、醛糖1-差向异构酶及参与细胞葡聚糖代谢和细胞多糖代谢过程的葡聚糖内切葡聚糖酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶均显著上调，说明在枸杞果实在黄变初期时对比其青果期的各种糖的合成代谢程度显著增强，主要通过多糖、细胞壁多糖、葡聚糖的合成和分解过程积累寡糖，同时蔗糖代谢向果实以及其他生物过程提供所需的能量，可能是由于果糖激酶和己糖激酶将果糖和葡萄糖磷酸化为6-磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖，6-磷酸果糖进入糖酵解和三羧酸循环，从而产生能量和其他过程的中间体，蔗糖也通过蔗糖合酶或蔗糖磷酸合酶重新合成，所以在黄变时期寡糖含量再次升高。S3时期发现共有关键差异蛋白106 个，主要集中在淀粉分解代谢、细胞壁多糖代谢、纤维素和半纤维素降解、多糖水解、葡聚糖水解和单糖的代谢等生物过程中，该时期各种多糖的分解代谢使枸杞果实中的寡糖不断积累其含量显著上升，说明枸杞果实在成熟的后期，主要以多糖的分解代谢形成寡糖为主。在S4时期枸杞的果实已经完全成熟，对比S3生长时期枸杞果实中的寡糖含量的积累下降，表明寡糖的分解代谢增强，在糖水解酶的作用下，将果实中的寡糖进一步分解为蔗糖、果糖、己糖、戊糖和葡萄糖等单糖，之后进入糖酵解途径；从而导致在成熟期枸杞果实寡糖含量减少。 在枸杞不同的生长时期中寡糖含量的积累主要集中于蔗糖合成途径、果糖和甘露糖途径、淀粉合成代谢和细胞壁多糖合成代谢途径以及纤维素半纤维素的降解组成，这些途径互相转化，通过不同的差异蛋白共同协作调控寡糖的含量。由于寡糖的合成在枸杞生长过程中处于一个动态的变化，因此在其代谢调控中不同发育时期及不同途径蛋白的表达具有差异性。 
图4表明，在S2时期中，蔗糖合成途径和细胞壁多糖的代谢途径中蔗糖磷酸合酶、蔗糖合酶、中性转化酶和UDP-葡萄糖4-差向异构酶为显著上调表达；在淀粉合成途径中蔗糖合酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶和淀粉分支酶II显著上调。进入S3时期后发现α-淀粉酶、β-淀粉酶、蔗糖磷酸核酶和蔗糖-6-磷酸酶表达显著上调同时β-呋喃果糖苷酶依然显著上调。与此同时果糖激酶的显著上调表达使得纤维素逐步降解，结果表明，蔗糖合成和降解均增强，UDP-葡萄糖减少，使得淀粉的合成减弱；以上结果说明寡糖实现短时期的积累主要是来源于淀粉水解、蔗糖合成和细胞壁多糖分解。 在S4对比组中，果实细胞壁多糖降解显著增强，同一时期中淀粉分解代谢过程依然较强，果实细胞壁多糖中纤维素和半纤维素继续发生降解。UDP-阿拉伯吡喃糖变位酶表现为显著上调，结果表明阿拉伯聚糖的合成在增强。而淀粉的分解在此时期增强，细胞壁多糖的降解，蔗糖的合成共同调控枸杞果实寡糖的积累，使得寡糖含量在此时期上升。在S5后期，各种糖的合成明显减弱，细胞壁多糖和淀粉的分解代谢较前两个时期减弱，但在成熟期寡糖形成中所占比例较大，所以蔗糖合成减弱，使得寡糖含量逐渐减少。 为验证本实验筛选出参考基因的可靠性，选取10 个在枸杞果实寡糖的基本代谢途径中进行多种生物合成的酶进行酶基因水平检测分析。如图5所示，通过测定枸杞寡糖生物合成相关功能基因MdUFGT的表达模式验证本研究筛出参考基因的可靠性，结果发现在枸杞果实整个生长成熟过程中有些表现出相似趋势。蔗糖磷酸合酶（A0A059T2S5）表达量呈现先上升再降低的趋势，在S3时期表达量最高。S1～S2时期的己糖基转移酶（A0A0V0IJI5）和蔗糖合酶（M0ZT40）的表达量明显增加且达到最高，而后减小，在S5时期呈现出增加趋势。而果糖激酶（P37829）、甘露聚糖内-1,4-β-甘露糖苷酶（M0ZVJ3）、棉子糖合酶（A0A0V0ITL0）的表达量均呈现先降低再上升的趋势；鼠李糖生物合成酶（A0A0V0HSE1）与α-甘露糖苷酶（A0A0V0IX45）在整个过程中表达量均呈现出先降低再升高的趋势，在S1和S2时期持续降低，在S3时期表达量显著增加。β-呋喃果糖苷酶（G9IHI6）在S1～S4时期一直持续升高，而在S4时期之后逐渐降低。葡聚糖内切酶的表达量在S2～S4时期呈现升高趋势，而在S4时期表达量增加至最高后减小。这些酶的基因表达模式与蛋白组学分析的结果一致，为枸杞生长发育过中寡糖的合成代谢提供理论数据。 本研究探究了枸杞果实生长发育时期中寡糖含量的变化规律，并筛选出1 799 个差异表达蛋白，鉴定出133 个与寡糖的合成代谢相关的蛋白。在S2～S4时期的蛋白含量差异较大，主要集中在光合作用、淀粉分解代谢、细胞壁多糖代谢、纤维素和半纤维素降解、多糖水解、葡聚糖水解和单糖的代谢等过程中。其中，S3时期是一个拐点，该时期枸杞果实中寡糖含量最低，通过蛋白组学鉴定出106 种差异蛋白，这些蛋白通过参与淀粉水解、蔗糖合成和细胞壁多糖分解促进寡糖的一个变化。此外，通过real-time PCR方法进行验证，其结果与蛋白组学数据一致，具有参考价值。 本文《枸杞果实生长发育过程中寡糖代谢的蛋白组学分析》来源于《食品科学》2023年44卷12期115-123页. 作者：高鹏燕, 李佩佩, 刘军, 马琴, 刘敦华. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220503-027.
