食品界

FSHW | 马铃薯蛋白酶抑制剂可以作为一种具有抗氧化和抗癌潜力的功能性食品材料

Introduction

众所周知，癌症的发生与人体的过度氧化反应密切相关。许多具有抗氧化活性的生物活性物质也具有一定的抗癌能力。特别是植物源活性物质因其较小的副作用而受到高度重视，用以预防各种疾病。

蛋白酶抑制剂（PIs）广泛存在于块茎和植物种子中，可以抑制病原体的生长，促进伤口愈合。此外，PIs还可以作为贮藏蛋白质，是种萌发重要来源。长期以来，由于多数研究均是以短时间内食用含有大量PIs饲料的小动物为研究对象，从而使PPIs在营养学角度上被认为是一种抗营养因子，而这种饮食模式在与人们日常饮食几乎是不相符的。因此，应该正确看待PIs对人类健康的影响。

马铃薯蛋白酶抑制剂（PPI）是马铃薯分离蛋白的主要成分，占总蛋白的50%，根据蛋白质结构可分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和羧肽酶抑制剂。PPIs中必须氨基酸含量高，如丝氨酸、亮氨酸和谷氨酸，具有功能性的氨基酸如异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸含量也较高。研究报道PPIs可以调节体内蛋白水解活性，抑制肿瘤生长，保护肝脏，维持健康的免疫系统等，对维持正常的生命活动具有重要意义。为了在功能性食品和生物医学领域得到更广泛的应用，有必要证明无毒前提下PPIs在细胞水平上可以具有令人满意的抗氧化和抗肿瘤活性。

沈阳农业大学食品学院李苏红教授、李拖平教授等在前序研究的基础上以PPIs为研究对象，分析其在细胞水平上是否具有抗氧化和抗肿瘤活性。结果表明PPs可以显著降低H₂O₂诱导的人肝细胞癌（HepG2）细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的氧化损伤，抑制细胞形态变化，保持细胞完整性。此外，PPIs对GIST882细胞生长、迁移和侵袭均具有很好的效抑制作用。这些发现可以为PPIs作为功能性食品材料提供科学依据。

Results and Discussion

PPIs抗氧化能力评价

在本研究中，作者首先利用PSC和CAA方法评估PPI的抗氧化活性。通过PSC评估PPIs的体外总抗氧化活性，随着PPIs浓度的增加，PPIs的PSC值从（233±86）mg VCE/100 g提高到（2119±204）mg VCE/100 g。在此基础上，通过CAA评估PPs对细胞整体以及在细胞内抗氧化作用。结果表明，未经PBS洗涤的PPIs的CAA值（8.74±2.1～45.83±3.5µmol QE/100 g）高于经PBS洗涤PPIs的CAA值（3.3±5.3~33.25±4.4 µmol QE/100 g）。这是因为未经PBS洗涤的CAA值代表PPI在细胞膜和细胞内的抗氧化活性，经PBS洗涤的CAA值仅代表PPIs在细胞中抗氧化剂的活性。

图1 PPIs的PSC和CAA值

对细胞样化损伤的保护作用

正常生长的HepG2细胞呈梭形，HUVEC细胞呈多边形。两种细胞均大小均匀，边缘清晰光滑。经H₂O₂处理后，可以观察到HepG2细胞和HUVEC细胞收缩，形态不规则，出现细胞碎片。经PPIs预处理后损伤细胞数量明显减少，黏附程度增加，细胞形态更加丰满，细胞边缘更加清晰光滑。

图2 PPIs对HepG2和HUVEC细胞形态变化的影响

为了评估 PPIs对HepG2和HUVEC细胞氧化损伤的影响，分别研究了细胞的LDH释放率、MDA、SOD 和NO水平的变化。如表1所示，H₂O₂处理后的HepG2 和 HUVEC 细胞的MDA水平和 LDH释放率着增加。PPIs预处理后HepG2 和 HUVEC 细胞的MDA水平和LDH释放率明显降低。此外，H₂O₂ 处理后的HepG2 和 HUVEC 细胞中SOD活性和NO水平显着降低，PPI预处理后可以显着阻止下降趋势。

表1 PPIs对HepG2和HUVEC细胞氧化损伤的保护作用

PPIs的抗肿瘤活性

以四种肿瘤细胞（A549、MKN45、K568和GIST882）为研究对象，探索PPIs的抗肿瘤活性。PPI对GIST882细胞株的抑制活性最高，IC₅₀值为（10.53±3.87）mg/mL，对MKN45和K568细胞株有显着抑制作用，IC₅₀值为（186.60±5.37）和（178.21± 3.13) mg/mL，但对 A549 细胞系未发现明显影响。

如图3所示，随着PPIs浓度的增加，处于S期的GIST882细胞在百分比从33.88%增加到51.87%；处于G2/M期的GIST882细胞百分比从 12.46%增加到25.12%；处于G0/G1期的GIST882细胞百分比从53.66%下降到26.9%。PPIs可以在S期和G2/M期阻滞细胞周期，影响GIST882细胞的正常分裂，抑制其生长。

图3 PPIs对不同肿瘤细胞的抑制率（A）和对GIST882细胞周期的影响（B）

细胞凋亡的AO/EB分析如图所示。正常生长细胞呈绿色，结构清晰，细胞膜完整；晚期凋亡细胞呈现橘色。经PPIs处理后的GIST细胞铁壁能力变差，形态发生变化，伴有明显的膜起泡和核收缩。同时，随着PPIs浓度的增加，GIST882细胞数量减少，凋亡形态变得更加清晰。细胞凋亡的膜联蛋白 V-Alexa Fluor 488/PI 染色分析如图4所示。结果表明，随着 PPIs 浓度的增加，Q2 和 Q4 的百分比逐渐增加。随者PPIs浓度的增加，处于Q2和Q4的GIST882细胞总凋亡百分比分别为18.6%、30.9% 和 57.6%。

图4 PPIs对GIST882细胞凋亡的影响

GIST882细胞48 h伤口愈合试验的结果如图5所示。PPIs降低了GIST882细胞的迁移率，说明PPIs可以有效抑制癌细胞转移，防止癌症恶化。

图5 PPIs对GIST882细胞迁移的影响

Conclusion

在本研究中，作者发现 PPIs具有良好抗氧化和抗癌活性。PPIs对由H₂O₂诱导HepG2和HUVEC细胞的损伤具有保护作用，且无毒性。此外，PPIs还可以抑制GIST882肿瘤细胞的生长，将其阻断在S期和G₂/M期并抑制其迁移能力。

第一作者

刘垚彤，女，农学硕士，现就读于东北农业大学食品学院，主要研究方向为马铃薯蛋白功能性研究；蛋及蛋制品加工。以第一作者发表EI论文1篇，SCI论文3篇；以第三发明人获国家实用新型专利授权1件，以第二发明人申请国家发明专利1件.

边媛媛，女，工学博士，现为沈阳农业大学食品学院讲师，主要研究方向为谷物功能食品加工。主要从事粮食工程方面的教学与研究，承担“食品试验设计与数据处理”、“气力输送”、“杂粮加工学”及“方便食品加工学”等课程，高质量完成教育教学任务。积极投身教学改革，校级教学立项“粮食工程专业“技术型”与“应用型”双目标培养模式探索研究”、指导本科生参加第八届食品创新大赛获得一等奖。

通信作者

李苏红，女，沈阳农业大学食品学院教授，粮油全值化加工与利用研究团队带头人，沈阳市拔尖人才，辽宁省食品质量安全学会常务理事、辽宁省食品营养学会常务理事。主要研究方向为粮油食品生物加工、糖苷酶作用机制与利用。兼任辽宁省食品质量安全学会常务理事、辽宁省食品营养学会常务理事；国家自然科学基金委函评专家、国家博士后基金评审专家、教育部留学人员科研启动基金评审专家、中国农业科学院学位论文评审专家等近年来主持及参与国家自然科学基金、国家科技部、教育部及省科技厅各类项目20余项；在《Ultrasonics Sonochemistry》、《Journal of Agriculture and Food Chemistry》、《Food Chemistry》、《International Journal of Biological Macromolecular》、《LWT- Food Science and Technology》、《食品科学》等本领域国内外重要期刊上发表论文60余篇，已授权发明专利17件，申请国家发明专利20余件，研究成果获得省、市及专业学会奖励10余项.

李拖平，男，沈阳农业大学食品学院教授，博士生导师，农产品商品化技术团队带头人，沈阳市领军人才，江苏省创新创业双创人才，辽宁省工业企业科技特派员，中国农学会农产品贮藏加工分会理事，中国菌物学会食用菌采后与加工产业分会理事。主要从事食品化学与营养和食品生物技术方面的研究工作，并兼任《Food Research International》和《Pharm Mag》编委。先后承担完成国家自然科学基金、国家重点研发专项、国家科技支撑、国家农转资金、国家外专局、教育部和省市及横向开发项目多项，授权国际发明专利6件，国内发明专利20余件，申请中专利10余件。在国内外期刊公开发表学术论80余篇，其中SCI检索论文50余篇。曾获辽宁省科技进步奖，沈阳市科技进步奖，中国食品学会科技创新奖和中国中医药研究促进会国际科技合作奖等多项科技奖励。

Potato protease inhibitors, a functional food material with antioxidant and anticancer potential

Yaotong Liu^a,1, Yuanyuan Bian^a,1, Yan Bai^b, Siqi Yu^a, Yuxuan Tian^a, Jie Li^c, Suhong Li^a,*, Tuoping Li^a,^*

^a College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

^b College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China

^c College of Pharmaceutical Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China

*Corresponding authors.

Abstract

Potato protease inhibitors (PPIs), as the main component of potato protein isolate, have good safety, nutrition and great market potential. The antioxidant and anticancer properties of PPIs were evaluated with cell-based biological assays. The results showed that when the concentration of PPIs was 5 mg/mL, the peroxyl radical scavenging value was (2119 ± 204) mg VCE/100 g, and the cellular antioxidant activity values were (45.83 ± 3.5) (no PBS wash) and (33.25 ± 4.4) µmol QE/100 g (PBS wash). Cells pretreated with PPIs could significantly prevent the oxidative damage induced by H2O2, inhibit the morphological changes of cells and maintain the integrity. Furthermore, PPIs had selective anti-proliferative effects on GIST882 cells (IC50 = (10.53 ± 3.87) mg/mL) and demonstrated potent inhibition of the growth, migration and invasion of cancer cells. These findings provide a scientific basis for PPIs as promising candidates for functional foods to aid in the prevention of oxidative damage and cancer.

Reference:

LIU Y T, BIAN Y Y, BAI Y, et al. Potato protease inhibitors, a functional food material with antioxidant and anticancer potential[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1762-1771.DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.027.