食品界

FSHW | 南极磷虾抗氧化肽呈现低IgE结合能力和RBL-2H3细胞脱颗粒率

Introduction

食物过敏是以常见食物引起的由免疫系统介导的特定不良反应，逐渐成为一个全球性的食品安全和公共卫生问题。虾是八大食物过敏原之一，虾及其制品引起的食物过敏人群比例相对较高。其中，原肌球蛋白被认为是主要过敏原蛋白，超过80%的虾过敏者对其具有过敏反应。此外，精氨酸激酶、肌浆钙结合蛋白、磷酸丙糖异构酶和血蓝蛋白等也是虾中的常见过敏原。因此，降低虾的致敏性，提高其食用价值，是亟待解决的问题。

南极磷虾是一种具有出色发展潜力的海洋生物资源，所含蛋白质约占其干重的60%~65%，且其具有人体所需的9种必需氨基酸，营养价值较高。近年来，南极磷虾蛋白肽的生物活性研究为实现南极磷虾的高值化利用奠定了良好的基础。此外，酶水解不仅可以增强蛋白质的部分功能特性，产生分子量较小的生物活性多肽，还可以改变过敏原的线性或非线性表位，降低抗原性。目前，酶水解被证明是更安全、更有效地降低过敏原致敏性的关键处理方法。然而，很少有研究调查南极磷虾抗氧化剂肽成分的致敏性。

IgE抗体可介导超敏反应，其识别的连续表位数量可能与过敏反应的严重程度密切相关。而抗原特异性IgG1被认为是一种新型诊断方法，亦可为识别食物过敏原的潜在严重程度提供证据。此外，IgE与抗原偶联物可激活大鼠嗜碱性白血病(RBL)细胞脱颗粒并触发炎症因子的释放。其中，β-氨基己糖苷酶(β-Hex)是一种较好的生物标志物，不易快速分解，且方法简单、快速、灵敏。

因此，大连工业大学食品学院丁婕、孙娜教授、林松毅教授等在本文中通过酶解和分离纯化获取南极磷虾抗氧化活性蛋白肽，借助血清学分析与细胞免疫学模型检测南极磷虾抗氧化蛋白肽的特异性IgE、IgG1结合能力和RBL-2H3细胞脱颗粒率以评价其变应原性，为南极磷虾的高价值利用提出了新的想法，并为生产具有较低变应原性的抗氧化多肽提供了潜在来源。

Results and Discussion

南极磷虾抗氧化肽的分离纯化：将南极磷虾水解产物(AKHs)分离获取4种组分(N1，<3 kDa; N2，3~10 kDa; N3，10~30 kDa; N4，>30 kDa)，随后将抗氧化活性较高的N2进一步纯化获得3种组分，进而筛选出高抗氧化活性南极磷虾肽，其DPPH和OH自由基的清除率如图1和图2所示。其中，分离组分N2的抗氧化活性较高，其DPPH自由基清除率为(47.43 ± 2.18)%，OH自由基清除率为(28.35 ± 0.91)%。而N1、N3、N4的自由基清除能力依次下降。此外，纯化组分N2-2的抗氧化活性最高，其DPPH自由基清除率为(47.43 ± 2.18)%，OH自由基清除率为(34.33 ± 1.25)%。

图1 南极磷虾蛋白肽的DPPH自由基清除率

图2 南极磷虾蛋白肽的OH自由基清除率

构建南极磷虾致敏BALB/c小鼠模型：图3为南极磷虾致敏小鼠模型构建过程中的体重、摄食量和饮水量。与对照组相比，南极磷虾致敏后对BALB/c小鼠无病理性有害影响。表1为小鼠脏器系数，只有脾脏器系数存在显著差异。图4为小鼠血清中总IgE和IgG1水平，结果表明，第27天和第35天采集的小鼠血清中的总IgG1和IgE水平均明显高于对照组血清，致敏小鼠模型成功建立，而第27天采集的小鼠血清中的IgG1和IgE总水平更高，因此被选用于进一步研究中。

图3 南极磷虾致敏对BALB/c小鼠体重、摄食量和饮水量的影响
表1 小鼠脏器系数

图4 南极磷虾致敏小鼠血清中的总IgE和IgG1水平

南极磷虾抗氧化肽与特异性IgG1和IgE的结合能力：IgE和IgG抗体可能由变应原诱导产生。南极磷虾抗氧化蛋白肽组分的特异性IgG1和IgE结合能力如图5所示，以阐明其潜在变应原性。结果表明，经酶水解和分离纯化后，南极磷虾蛋白肽组分与特异性IgE、IgG1的结合能力有所降低。其中，南极磷虾与特异性IgG1结合能力更强，AKHs与特异性IgE结合能力更强，抗氧化活性较高的分离组分N2与特异性IgE和IgG1的结合能力显著降低，纯化组分N2-1与特异性IgE结合能力更弱，而N2-1和N2-2与特异性IgG1结合能力更弱且二者无显著差异。

图5 南极磷虾抗氧化蛋白肽与特异性IgE和IgG1的结合能力

南极磷虾抗氧化肽的RBL-2H3细胞脱颗粒率：RBL-2H3细胞是在免疫反应中起关键作用的一类效应细胞，可被IgE抗体激活引发脱颗粒，释放β-Hex、组胺和其他过敏介质。图6为南极磷虾抗氧化蛋白肽诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒率，以评估其潜在变应原性。结果表明，酶水解和超滤可有效降低南极磷虾的致敏性，南极磷虾、AKHs和N2诱导的β-Hex最大释放率分别为(62.39 ± 1.33)%，(47.28 ± 1.78)%和(51.63 ± 0.91)%。此外，进一步地纯化亦可有效抑制南极磷虾过敏原诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒，N2-2的β-Hex最大释放速率显著降低为(24.85±0.62)%，且其EC₅₀值最高，为(5.29 ± 0.95) ng/mL，约为南极磷虾的13.80倍。

图6 南极磷虾抗氧化蛋白肽诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒率

Conclusion

以南极磷虾粉为研究对象，经酶水解后从中分离纯化获取抗氧化蛋白肽，对其变应原性进行评价。EPR结果表明，分离组分N2具有较高的DPPH和OH自由基清除率，分别为(47.43 ± 2.18)%和(28.35 ± 0.91)%。纯化组分N2-2的抗氧化活性更高，DPPH自由基清除率为(47.43 ± 2.18)%，OH自由基清除率为(34.33 ± 1.25)%。此外，ELISA测定结果表明，N2-1和N2-2与特异性IgE和IgG1的结合能力较弱。细胞脱颗粒试验结果表明，N2-2的变应原性更低，EC50值为(5.29 ± 0.95) ng/mL，约为南极磷虾的13.80倍。N2-2可能是低变应原性的潜在抗氧化肽成分。

第一作者

丁婕，女，大连工业大学食品学院国家海洋食品工程技术研究中心在读博士研究生，主要研究方向为食品功能与营养及食品蛋白质资源开发与利用。在国内外期刊公开发表学术论文2篇，其中SCI收录2篇。

通信作者

林松毅，女，工学博士，二级教授，博士生导师，辽宁省特聘教授，辽宁省教学名师，国家重点研发计划基础研究项目首席，大连市领军人才；入选2021年度全球顶尖TOP10万科学家榜单。现任大连工业大学研究生学院院长、国家海洋食品工程技术研究中心朱蓓薇院士团队食品功能与营养方向带头人、辽宁省食品工程技术研究中心副主任；兼任教育部高等学校食品科学与工程类教学指导委员会副秘书长、中国工程教育专业认证专家组组长、食品类专业认证委员会委员、中国食品科学技术学会高级会员、中国食品科学技术学会非热加工技术分会副理事长、中国食品营养学会营养与保健食品分会副主任委员、《肉类研究》期刊编委等；兼任国家科学技术奖励/“长江学者奖励计划/“青千计划”、国家重点研发计划政府间专项等通讯评审专家和中国轻工业联合会科技奖及十余个省部级科技奖励评审专家；先后主持国家重点研发计划基础研究项目1项、国家自然科学基金面上项目2项、863项目子课题1项、国家“十二五”科技支撑子课题1项、省级科技成果转化项目4项、省级科技计划重点项目3项、校企合作项目近10项；以第一或通讯（含并列通讯）作者已公开发表SCI收录论文142篇（其中JCR一区论文73篇）和EI收录论文31篇，ESI高被引论文3篇、热点论文1篇；以第一发明人申请发明专利52项，授权发明专利27项；主编（含并列主编）出版教材5部。主要从事研究领域为食品功能与营养、食源性蛋白肽靶功能作用机理、食品非热加工PEF技术应用。

Antarctic krill antioxidant peptides show inferior IgE-binding ability and RBL-2H3 cell degranulation

Jie Ding^a,b, Chunyan Zhu^c, Pengfei Jiang^a,b, Libo Qi^a,b, Na Sun^a,b,*, Songyi Lin^a,b,^*

^a National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

^b Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

^c Ganzhou Quanbiao Biological Technology Co., Ltd., Ganzhou 341100, China

*Corresponding authors.

Abstract

Enzymatic hydrolysis, isolation, and purification might make a great deal of difference in antioxidant activity and antigenicity of peptide components. This study aimed to isolate and purify antioxidant peptide components from Antarctic krill and evaluate their allergenicity of them. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy results indicated 3-10 kDa Antarctic krill hydrolysates (AKHs) had higher DPPH and ·OH radical scavenging rates. And the second component (N2-2) purified 3-10 kDa hydrolysate showed better ability to scavenge DPPH and ·OH radicals (P < 0.05), which were (47.43 ± 2.18)% and (34.33 ± 1.25)%, respectively. Additionally, indirect-ELISA results revealed that N2-1 had a weaker ability to bind specific IgE and that N2-2 had a lower binding capability to specific IgG1 (P < 0.05). And N2-2 had a higher EC50 value of (5.29 ± 0.95) ng/mL (P < 0.05) in cell degranulation assay, which was about 13.80 times that of Antarctic krill. Therefore, N2-2 might be the potential source of the antioxidant peptides with lower allergenicity.

Reference:

DING J, ZHU C Y, JIANG P F, et al. Antarctic krill antioxidant peptides show inferior IgE-binding ability and RBL-2H3 cell degranulation[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1772-1778.DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.028.