食品界

湖南农业大学谭君副教授等：不同品种葡萄中58 种挥发性物质的稳定同位素内标GC-MS SIM法分析

葡萄（Vitis vinifera L.）既可以作为水果直接食用（鲜食葡萄）也可进行加工使用（葡萄酒）。香气是衡量葡萄果实品质的重要指标之一。香气物质通常以游离态或者结合态的形式存在于葡萄的果肉和果皮中，与糖苷相结合的形式（结合态）不具有挥发性，对葡萄果实香气没有直接的贡献作用，但是它们经过酶促或非酶促反应将产生游离态的气味活性物质，可增强葡萄的果实香气特性；而游离态的形式主要是挥发性的物质，可直接被人感知并构成葡萄的特色香气。

湖南农业大学园艺学院张雪枫，李杰、谭君*等在对几种特殊的挥发性物质的特征碎片离子开展质谱碎裂机理研究的基础上，挖掘58 种挥发性物质的质谱定性与定量特征离子，构建葡萄果实中挥发性物质准确测定的GC-MS选择离子监测（SIM）技术，应用稳定同位素标记的内标物质对不同品种葡萄果实样品中目标挥发性物质进行精准定量，以期探究葡萄果实中关键优势挥发性物质，以及不同品种的特色挥发性物质，为葡萄果实的挥发性物质研究奠定方法学基础，并为水果香气物质研究提供理论依据。

01 建立GC-MS SIM分析

采用电子电离源对葡萄果实样品进行GC-MS Scan检测，通过NIST 17标准质谱库检索对主要挥发物信号峰进行定性（图1）；结合标准品的色谱保留时间和质谱信息比对，进一步确证样品中的挥发性物质；并参考文献报道的结果，筛选58 种主要的挥发性物质作为本研究的目标物。在此基础上，对58 种挥发物的混合标准溶液进行GC-MS Scan分析，确定各挥发物的保留时间；依据文献报道的SIM离子挑选规则，筛选每个目标物合适的碎片离子，进行SIM分析。结果表明，在1.3.3节仪器工作条件下，各目标物峰形良好，实现基线分离，有效降低了基线噪音的干扰。

02 挥发性物质的质谱裂解机理

如图2所示，芳樟醇（图2a）和香叶醇（图2b）为同分异构体，其相对分子质量均为154.25，但质谱裂解后的碎片离子差异较大，由图2a、b可知，NIST标准质谱图中，丰度最高的分别为m/z 71（芳樟醇）和m/z 69（香叶醇）的碎片离子，作为GC-MS SIM定量离子，对应的定性离子分别为芳樟醇m/z 93和m/z 121、香叶醇m/z 41和m/z 123（表1）。而对于(E)-2-己烯基醛而言，其NIST标准质谱图（图2c）中，丰度最高的离子为m/z 41，丰度其次的离子较多，但由于m/z 41的CH₃离子（图2b）为绝大多数脂肪族有机物质的共有质谱碎片离子，且该物质与s-2-甲基-1-丁醇和异戊醇保留时间近干扰较大，故如表1所示，选择其丰度较低而m/z较大的特征碎片离子m/z 98、97、83作为GC-MS SIM分析的定性定量离子，对应的质谱裂解机理如图2c所示。

03 内标物的选择

参考文献报道的内标标准曲线法，选择稳定性同位素全氘标记的正丁醇（氘代正丁醇）作为内标物。该内标物为氢（¹H）元素的稳定同位素氘（²H）标记的化合物。

同1.3.1节分别配制外标法和内标法的混合标准工作液进行GC-MS SIM检测（条件同1.3.3节），绘制不同浓度目标物的定量离子峰面积Y与物质质量浓度X（mg/L）之间的外标标准曲线；并以不同质量浓度目标物定量离子与内标物定量离子的峰面积比值作为纵坐标，以目标物含量作为横坐标，绘制内标标准曲线，结果见表1。内标法较外标法的线性拟合相关性更强，线性相关系数值（R）较高。故本实验以氘代正丁醇作为内标物质进行准确的GC-MS SIM内标定量分析，如表1所示，在各目标物的适应质量浓度范围内，该方法呈现良好的线性相关，除了异丙醇（R=0.967 1），其他挥发性物质的R值均高于0.9950。

04 方法学验证

通过计算上述不同加标水平的回收率结果之间的RSD，考察方法的重复性。表1结果表明，在低的加标水平下，除极少数挥发性物质之外，其他挥发物加标回收率结果之间的RSD均小于28.78%；而在高加标水平下，除正辛醇（33.26%）和棕榈酸乙酯（31.55%），其他挥发物的RSD均低于19.56%，方法稳定且重复性好。

05 葡萄果实样品中挥发性物质的分析

5.1 总挥发性物质含量的品种差异分析

将上述GC-MS SIM稳定同位素内标法，应用于不同品种葡萄果实样品的检测，共检出36 个挥发物（图3），不同品种中挥发性物质的种类与含量差异明显。1）所有12 个葡萄品种中，挥发性物质总量最高的品种（‘阳光玫瑰’9.35 mg/kg）与总量最低的品种（‘湘刺3号’0.77 mg/kg）相差十几倍；2）‘湘刺1号’‘湘刺2号’‘湘刺3号’‘湘刺4号’和‘紫秋’五个品种的挥发性物质总量相对较低，其中总量最高的‘紫秋’为4.81 mg/kg，其余4 个品种的总量在2.29～2.80 mg/kg之间（除‘湘刺3号’）；3）多用于酿酒的4 个品种‘西拉’‘梅洛’‘黑比诺’和‘赤霞珠’中，‘西拉’挥发性物质总量较高（6.09 mg/kg），但4 个品种间差异并不显著，总量在3.26～3.99 mg/kg之间；4）其余3 个葡萄品种‘夏黑’‘阳光玫瑰’和‘春光’多用于鲜食，挥发性物质总量均相对较高，且此3 个品种间存在显著差异。

5.2 不同葡萄品种的优势挥发性物质分析

由图4可知，在检出的36 个挥发性物质中，(E)-2-己烯基醛（20）、己醛（13）、苯乙醛（44）、丙酸酐（30）和叔丁醇（4）为不同品种葡萄果实中的绝对优势挥发性物质，除了‘黑比诺’（59.06%）、‘春光’（67.32%）和‘夏黑’（71.19%），其他品种中此5 种挥发性物质的含量占总量的94.56%以上；其中(E)-2-己烯基醛、己醛和丙酸酐占总量的3/4以上。此外，除‘黑比诺’之外，所有品种中(E)-2-己烯基醛和己醛的含量占目标物总量的50%以上，为含量最高的2 个挥发性物质。

而‘黑比诺’的挥发性物质呈现较为丰富的分布，除上述优势目标物之外，苯乙醇（56）、苯甲醇（55）正戊醇（25）和丙酸乙酯（6）的含量也较高。多用于鲜食的葡萄品种‘夏黑’‘阳光玫瑰’和‘春光’中，挥发性物质组成则更加丰富且品种间的差异明显，不同挥发物的相对比例显著不同。

5.3 挥发性物质的分布情况分析

对样品中检出的36 个挥发性物质的分布情况进行箱式图分析（图5），不同目标物的分布情况差异较大，尤其是己醛（13）、反式-2-己烯基醛（20）、丙酸酐（30）、苯乙醇（56）、苯乙醛（44）和苯甲醇（55）的样品分布差异显著，应为重点关注的葡萄果实中挥发性物质；结合2.5.2节结果证实，此6 种关键性挥发物的样品分布差异，与其在不同样品中的优势含量密切相关。对图4进行放大处理后（右上角小图）发现，除了上述6 个关键性挥发物之外，橙花醇（50）、叔丁醇（4）、异戊醇（22）、正戊醇（25）、大马士酮（51）、香叶醇（53）在不同样品中的分布差异较为明显，应为不同品种葡萄果实中的特征性挥发物，橙花醇、大马士酮、香叶醇在‘夏黑’‘阳光玫瑰’和‘春光’中的含量较其他品种高上百倍甚至上千倍；异戊醇仅在‘春光’和‘夏黑’中有检出；叔丁醇和正戊醇在不同品种中均有检出，但其含量差异较大。结果表明，大马士酮、香叶醇和异戊醇为‘夏黑’‘阳光玫瑰’和‘春光’区别于其他品种的特色挥发物。

06 结论

建立对葡萄果实中58 种挥发性物质进行同时准确定性与定量分析的GC-MS SIM方法，在解析目标物的质谱裂解规律的基础上，筛选各挥发物的特征碎片离子，并构建稳定同位素内标标准曲线法对12 个不同品种的葡萄样品中挥发物含量进行精准定量；同时对该方法的空白、LOD、线性与范围、准确性和重复性等指标进行方法学验证，结果表明该方法有效排除分析中样品复杂基质的干扰，增强目标物的响应信号、降低基线噪音，大大提高了分析的灵敏度与准确性。此外，通过对不同品种葡萄果实中挥发性物质的系统分析发现，己醛、反式-2-己烯基醛、丙酸酐、苯乙醇、苯乙醛和苯甲醇为葡萄果实中的关键性优势挥发性物质；大马士酮、香叶醇和异戊醇为‘夏黑’‘阳光玫瑰’和‘春光’三种适于鲜食的葡萄中特色挥发物；叔丁醇和正戊醇为不同品种的差异挥发物。

本文《同品种葡萄中58 种挥发性物质的稳定同位素内标GC-MS SIM法分析》来源于《食品科学》2023年44卷12期262-269页. 作者：张雪枫，李杰，陈彦彤，何雪，陈文婷，杨国顺，谭君. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220823-267.