西南大学陈科伟副教授等:基于UPLC/Q-TOF-MS技术分析人乳中VD及其酯类分布规律
2023-10-07作者:来源:责任编辑:食品界
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人乳被认为是婴儿最安全、最完整的天然食物,但人乳中VD的含量通常对婴儿来说很少。根据《中国婴幼儿喂养指南(2022)》,纯母乳喂养的婴儿出生后数日开始每日补充10 μg VD。人乳中的脂肪酸大部分为饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸,人乳中的VD能够和这些脂肪酸结合形成VD酯。虽然人乳脂中VD及其酯类含量占比较少,但是对于婴儿营养吸收及正常代谢十分重要。目前,我国对不同泌乳阶段人乳VD及其酯类的定性定量分析研究较少。
西南大学食品科学学院的丁德胜,陈科伟*和重庆医科大学附属第一医院妇产科的王龙琼等利用超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)检测技术对人乳中VD及其酯类进行定性定量分析,比较不同泌乳阶段(初乳0~7 d、过渡乳8~15 d、成熟乳16 d以后)VD和VD酯的组成和含量差异。VD作为人乳中不可或缺的重要成分,了解和掌握人乳中VD及其衍生的VD酯的组成和含量将为婴儿配方食品的生产和配方改良提供科学依据和数据支持,对于我国乃至世界婴儿配方食品产业具有重要意义。
如图1所示,VD分子含有羟基,能与脂肪酸酯化形成各种VD酯。本实验采用UPLC/Q-TOF-MS在APCI+模式下对采集的108 份人乳样品中的VD和VD酯进行检测分析。如表2所示,根据各种物质在色谱柱中的保留时间不同,除检测到VD2、VD3、25-羟维生素D3和1,25-二羟维生素D3外,还检测到12 种维生素D2酯和8 种VD3酯,且均为与长链脂肪酸结合的VD酯。检测到初乳中含有16 种VD酯,过渡乳中含有18 种VD酯,成熟乳中含有14 种VD酯。目前国内外对人乳中VD酯的组成和分布的研究较少。 为进一步确认VD酯,在APCI -模式下采集了不同VD酯的MS/MS片段,最终得到花生酸维生素D3酯(C20:0)、二十碳烯酸维生素D2酯(C20:0)、二十二碳烯酸维生素D2酯(C22:1)和二十二酸维生素D2酯(C22:0)的MS/MS片段,见图2。 不同泌乳阶段中的VD及VD酯含量分析结果见图3。由图3可以看出,初乳中VD2和25-羟维生素D3的平均质量浓度最高,分别为26.83 ng/L和160.67 ng/L;过渡乳中VD3的平均质量浓度最高,为119.87 ng/L;成熟乳中1,25-二羟维生素D3的平均质量浓度最高,为1.82 ng/L。使用SPSS 26.0对不同泌乳阶段的4 种VD进行单因素方差分析,在95%的置信度下不同泌乳阶段的VD含量有显著差异(P<0.05),采用Duncan法和LSD法多重比较检验结果,其中初乳和成熟乳之间的VD2含量存在显著差异;初乳和过渡乳之间的V3含量存在显著差异,过渡乳和成熟乳之间的VD3含量存在极显著差异(P<0.01);初乳和过渡乳之间以及初乳和成熟乳之间的25-羟维生素D3含量存在极显著差异。从初乳到成熟乳,VD2和25-羟维生素D3的平均含量呈现出逐渐下降的趋势,而VD3的平均含量呈现先上升后下降的趋势,1,25-二羟维生素D3的平均含量基本保持不变。初乳中VD2和25-羟维生素D3含量最高,这可能表明刚出生的婴儿需要较高含量的VD2和25-羟维生素D3以加快骨骼的形成和对钙的吸收。VD含量随着泌乳时间的变化而变化,这也许和母亲的饮食摄入有很大关系。VD含量的波动会影响婴儿骨骼的正常发育,摄入不足易患佝偻病,所以国内外相关膳食指南均建议婴儿出生两周后需要额外补充VD3。研究发现,人乳中的VD酯含量很低,甚至在有的人乳样品中未检测到VD酯,且不同个体中VD酯含量差异很大。初乳中VD酯平均质量浓度为11.89 ng/L,过渡乳中VD酯平均质量浓度为10.73 ng/L,成熟乳中VD酯平均质量浓度为11.47 ng/L。通过不同泌乳阶段VD酯的平均含量可以判断,从初乳到成熟乳,VD酯的含量几乎保持稳定。在人乳脂肪中,甘油三酯的含量大约占脂肪总量的98%,由此可见人乳中的脂肪酸大多以甘油三酯形式存在,仅存在少量的游离脂肪酸能够和VD结合形成VD酯。 不同个体之间的人乳脂肪存在着巨大的差异,即便是同一位母亲,其人乳成分会随着泌乳阶段而不断变化,而且同一天中乳脂成分的变化最大,甚至左右乳之间也存在显著差异。从图3可知,不同个体中的VD2、VD3、25-羟维生素D3、1,25-二羟维生素D3和VD酯含量均存在差异,这可能和个人的遗传因素、饮食习惯、健康水平、生活方式等因素以及婴儿的需求不同有关。很少有25-羟维生素D从母体循环进入人乳,取而代之的是,新生儿在人乳中以VD3的形式获得VD。人乳中的VD含量与母亲的血清VD水平相关,然而VD3会迅速转化为25-羟维生素D,这就减少了VD3转移到婴儿体内的可能性。这一发现表明,需要每天服用VD实现母乳转移。人乳中VD酯的形成可能是为了预防VD的过度积累,因此人乳中VD酯含量可能会因个体间VD的差异而有所不同。 
不同泌乳阶段中的VD酯组成和含量也不同,总体上看VD2酯的含量高于VD3酯,如图4所示。初乳中检测到9 种VD2酯和7 种VD3酯,其中十四碳烯酸维生素D2酯(C14:1)、十五碳烯酸维生素D2酯(C15:1)、二十二碳六烯酸维生素D2酯(C22:6)和二十四酸维生素D2酯(C24:0)含量相对较高。过渡乳中检测到11 种VD2酯和7 种VD3酯,其中十四碳烯酸维生素D2酯(C14:1)、十五碳烯酸维生素D2酯(C15:1)、二十酸维生素D2酯(C20:0)、二十二碳六烯酸维生素D2酯(C22:6)和二十四酸维生素D2酯(C24:0)含量相对较高。成熟乳中检测到8 种VD2酯和6 种VD3酯,其中十四碳烯酸维生素D2酯(C14:1)、十五碳烯酸维生素D2酯(C15:1)含量相对较高。同时可以发现十四碳烯酸维生素D2酯(C14:1)、十五碳烯酸维生素D2酯(C15:1)是整个泌乳阶段含量最高的2 种VD酯。 据报道,人乳脂中饱和脂肪酸的主要成分棕榈酸大概有70%位于甘油三酯的sn-2位,而主要的不饱和脂肪酸油酸、亚油酸大多数位于sn-1,3位。虽然人乳中这3 种脂肪酸含量较高,但是本研究仅在个别样本中检测到了亚油酸维生素D3酯(C18:2),未检测到棕榈酸维生素D酯和亚油酸维生素D酯。此外,亚油酸维生素D3酯(C18:2)在3 个泌乳阶段的含量普遍很低,并且从初乳到成熟乳呈现出逐渐降低的趋势。因此,人乳中含量较高的棕榈酸、油酸和亚油酸所对应的VD酯含量不一定高,甚至可能没有。 VD酯以及甘油酯的脂肪酸组成在很大程度上决定了人乳脂的理化性质和营养功能。亚油酸能降低血浆胆固醇水平,在皮肤和伤口的愈合中有促进作用,对应的亚油酸维生素D3酯(C18:2)在初乳中含量最高,这也许表明刚出生的婴儿需要较高水平的亚油酸维生素D3酯(C18:2)调节胆固醇水平,维持其正常发育。花生四烯酸能促进新生儿大脑、眼睛、心脏和神经系统的发育,对应的花生四烯酸维生素D2酯(C20:4)在过渡乳中含量最高。二十二碳五烯酸(EPA)参与抑制氧化应激、炎症反应、泡沫细胞形成、血小板聚集及血栓形成等过程,对应的二十二碳五烯酸维生素D2酯(C22:5)在初乳未检测到,这可能和EPA在初乳中的含量较低有关。二十二碳六烯酸(DHA)具有抗炎和抗氧化特性的作用,并且能影响新生儿神经发育和免疫功能的作用机制。对应的二十二碳六烯酸维生素D2酯(C22:6)在成熟乳中未检测到,这可能和DHA在成熟乳中的含量较低有关。
本研究运用MetaboAnalyst 5.0中的PLS-DA对不同泌乳阶段的人乳进行分析,得到了不同泌乳阶段所对应的判别曲面。如图5所示,初乳、过渡乳和成熟乳能够被较好分开,同时也观察到过渡乳和成熟乳的部分重叠,这能够说明人乳VD及VD酯从初乳到成熟乳发生了种类和含量上的变化。本研究共筛选出了4 种差异代谢物,分别为二十二碳四烯酸维生素D2酯(C22:4)、VD2、十五酸维生素D3酯(C15:0)和二十二酸维生素D2酯(C22:0),这也许和婴儿在不同泌乳阶段所需的营养物质不同有关。
如图6所示,亚油酸维生素D3酯(C18:2)、二十酸维生素D3酯(C20:0)和二十四酸维生素D3酯(C24:0)两两之间,二十酸维生素D2酯(C20:0)、二十碳三烯酸维生素D3酯(C20:3)和二十四碳烯酸维生素D2酯(C24:1)两两之间,花生四烯酸维生素D2酯(C20:4)、二十二碳四烯酸维生素D2酯(C22:4)和二十四碳烯酸维生素D3酯(C24:1)两两之间均呈十分显著正相关(P≤0.001),且具有极强的相关性(Pearson相关系数>0.85),说明两两之间的含量是同步变化的。另外,这9 种VD酯与人乳中其他VD酯大多呈极弱的相关性或无相关性。 
利用UPLC/Q-TOF-MS技术检测到108 份人乳中含有4 种VD及20 种VD酯,其中初乳中含有16 种VD酯,过渡乳中含有18 种VD酯,成熟乳中含有14 种VD酯。人乳中VD及VD酯含量存在较大的个体差异,其中初乳中VD2、25-羟维生素D3和VD酯的平均含量最高,过渡乳中VD3的平均含量最高,成熟乳中1,25-二羟维生素D3的平均含量最高。在整个泌乳阶段中,十四碳烯酸维生素D2酯(C14:1)的含量最高,仅在个别样品中检测到了亚油酸维生素D3酯(C18:2)、花生四烯酸维生素D2酯(C20:4)、二十二碳五烯酸维生素D2酯(C22:5)和二十二碳六烯酸维生素D2酯(C22:6)。通过PLS-DA表明,初乳、过渡乳和成熟乳能够被较好分开,说明VD及VD酯从初乳到成熟乳发生了种类和含量上的变化,并筛选出二十二碳四烯酸维生素D2酯(C22:4)、VD2、十五酸维生素D3酯(C15:0)和二十二酸维生素D2酯(C22:0)这4 种差异代谢物。不同VD酯之间表现出一定的相关性,它们的关联性依据还需要进一步研究。研究结果能为婴儿配方食品的开发提供数据支持。 本文《基于UPLC/Q-TOF-MS技术分析人乳中VD及其酯类分布规律》来源于《食品科学》2023年44卷第10期324-331页,作者:丁德胜,王龙琼,何小玲,庞文茜,李韵唱,王元楷,周凤兰,蔡 甜,陈科伟。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220628-319。