食品界

《食品科学》：江南大学杨方副教授等：基于微生物指标评价冷冻熟制小龙虾食用安全风险

小龙虾学名克氏原鳌虾（Procambarus clarkii），原产自美洲，20世纪30年代引进国内。目前我国小龙虾产业以鲜销为主，冷冻加工为辅。近两年受新冠病毒肺炎疫情的影响，预调味的冷冻熟制小龙虾产品在各大电商平台的销量激增。然而，预调味的熟制小龙虾为保证其独有的风味和质构，通常采用较低强度的方式杀菌（如巴氏杀菌），不能完全消灭细菌的耐热性孢子，且产品必须贮藏在冷冻条件下，以抑制细菌生长繁殖。有效抑制小龙虾产品中的优势腐败菌可以进一步提高冷冻熟制小龙虾的食用安全性。近年来，随着分子生物学的发展，用于检测食品中腐败菌的技术层出不穷，高通量测序作为新一代测序技术，具有信息量大、效率高的优点。

江南大学食品学院的公方朔，陈一丹，杨方*等选择市售真空包装冷冻熟制小龙虾，通过不同部分理化指标的变化确定食用终点，并利用高通量测序技术对食用终点熟制小龙虾的内脏与鳃、虾肉、虾壳以及调味汤料的细菌菌群进行分析，找出优势腐败菌，以期为开发优质冷冻熟制小龙虾产品提供理论指导。

1 熟制小龙虾冷冻过程中TVB-N值和pH值的变化

由图1可知，熟制小龙虾在冷冻期间TVB-N值总体呈上升的趋势，其中虾壳和调味汤料增长趋势较为缓慢，在整个贮藏期间TVB-N值均在安全限值（30 mg/100 g）以下；虾肉和内脏与鳃在冻藏期间TVB-N值持续增长，内脏与鳃在贮藏前120 d增长趋势较缓慢，由12.72 mg/100 g增加到17.84 mg/100 g，之后其数值快速增加，并在180 d时超过可接受上限，达到最大值（31.26 mg/100 g）。虾肉在30～60 d贮藏初期以及150～180 d贮藏末期TVB-N值增速较快，在180 d时达到32.42 mg/100 g。

由图2可知，相同贮藏时间熟制小龙虾体系不同部分样品间pH值具有显著差异（P＜0.05），其中虾壳和调味汤料呈现先上升后下降的趋势，这可能是由于贮藏前期虾壳以及调味汤料中溶解的蛋白质被降解，产生碱性小分子含氮化合物，导致pH值上升；而贮藏后期乳酸、琥珀酸和磷酸等酸性物质快速积累，使pH值下降。而虾肉、内脏与鳃的pH值呈缓慢下降趋势，始终处于弱碱性范围。

2 高通量测序结果分析

2.1 测序样本数据分析

所有样本测序基本数据如表1所示，4 个样品测序共获得229 219 条原始序列，过滤后得到226 160 条优化序列，进一步质控、拼接、过滤长度和嵌合体后共产生217 214 条有效序列，有效序列平均长度为421～425 bp，并且样品有效率在92.57%以上。将各样品有效序列按照97%的相似度进行聚类，得到OTU。由表1可知，虾壳OTU数量最多，为799；内脏与鳃OTU数量次之，为711；调味汤料和虾肉中OTU数量相对较少，分别为597和550。

根据不同部分所对应的OTU绘制维恩图，利用维恩图可以展示样品之间共有、特有特征OTU数目，直观地表现出样品间特征的重合情况，从而找出不同样品中的共有微生物。如图3所示，熟制小龙虾4 个部分含有266 个相同OTU，内脏与鳃、调味汤料、虾壳以及虾肉中独有的OTU数分别为47、110、75、17，说明熟制小龙虾不同部分细菌种类具有共性，但也存在一定差异。

2.2 熟制小龙虾样本Alpha多样性分析

如表2所示，所有样本测序的Coverage指数均大于0.99，即样品覆盖率高，序列未被检出的概率低，表明所得有效序列可用于后续分析。调味汤料Chao1和Ace指数最大，虾肉最小，表明调味汤料中菌群丰度最高，虾肉中最低。虾壳Shannon指数最大，虾肉最小，即虾壳中细菌多样性最高，虾肉中最低。

图4A为样本稀释曲线，随着测序深度逐渐增加，各样本稀释曲线趋于平缓，结合覆盖率数据，表明本研究测序结果可以反映熟制小龙虾不同部分的微生物情况。图4B等级-丰度曲线可以清晰反映出样本中物种丰富度和均匀度，由图4B可以看出，4 个部分在横轴上的分布长度由调味汤料、内脏与鳃、虾壳、虾肉依次递减，表明调味汤料细菌组成最为丰富，而虾肉中物种丰富度较低。此外，调味汤料的曲线较平坦，表明其均匀度最高，而虾肉和虾壳的曲线较陡峭，表明其物种均匀度较低。

2.3 熟制小龙虾不同部分腐败微生物群落结构组成分析

熟制小龙虾不同部分腐败菌群落门水平（丰度前10 位的菌种）组成如图5A所示，其中内脏与鳃、虾肉和虾壳中主要菌门为变形菌门（Proteobacteria），相对丰度分别为68.41%、74.77%和54.03%；其次为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度为9%～22%；此外，拟杆菌门（Bacteroidetes）在虾壳（14.58%）和内脏与鳃（8.40%）中也占有一定比例。在调味汤料中厚壁菌门占绝对优势，相对丰度为62.05%，变形菌门和拟杆菌门分别占19.78%和7.17%；其他菌门在各样本中所占比例均小于5%。总体来看，厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门为冷冻熟制小龙虾中的优势菌门，门水平上各部分细菌种类大致相同，但丰度具有较大差异。

选取相对丰度前10 位的菌属，探究属水平上的微生物多样性差异，结果如图5B所示。不同样本间的优势菌属有较大差异，主要为嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、弧菌属（Vibrio）和不动杆菌属（Acinetobacter）等。内脏与鳃中嗜冷杆菌属占主要优势，为47.86%，弧菌属（5.05%）也占有一定比例，而其他菌属占比均小于5%；虾肉中菌属群落结构和内脏与鳃中相似，以嗜冷杆菌属（42.31%）为主，还含有较多不动杆菌属（16.04%），以及少量弧菌属和Candidatus Arthromitus；调味汤料不同于以上两个样本，其含有大量的乳酸杆菌属（46.25%）；虾壳中优势菌属组成丰富，以弧菌属（21.72%）、乳酸杆菌属（19.38%）和嗜冷杆菌属（7.40%）为主。

选取丰度排名前50 位的菌属，根据其在各样本中的丰度信息进行聚类分析，颜色梯度由蓝色到红色表示菌属在样本中相对丰度由低到高。从图6可以看出，熟制小龙虾不同部分群落结构具有较大差异。通过聚类分枝的长度可知，内脏与鳃和虾肉的菌属结构相似，调味汤料、虾壳的菌属结构则相对独立。

2.4 熟制小龙虾不同部分样品菌群结构差异分析

主坐标分析（PCoA）如图7所示，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）解释度分别为60.62%和28.01%，叠加解释度达88.63%。各样本分散在4 个象限中，内脏与鳃和虾肉距离较近，表明其组内菌群结构有相似之处，而其他两组样本相距较远。因此，冷冻熟制小龙虾中不同部分之间的微生物结构差异较大。

3 结论

本研究以市售冷冻真空包装熟制小龙虾为研究对象，通过理化指标变化确定了熟制小龙虾在180 d时达到食用终点，利用高通量测序技术分析食用终点样本中不同部分的微生物多样性，发现熟制小龙虾不同部分的菌群结构和多样性具有差异。门水平上，内脏与鳃、虾肉、虾壳、调味汤料4 个部分中菌群以厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门为主，先前的研究表明变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门是熟制小龙虾的核心菌群。属水平上，内脏与鳃中主要为嗜冷杆菌属以及少量弧菌属。这是因为内脏与鳃中的微生物与小龙虾生长养殖环境有较大联系，小龙虾生长养殖环境较复杂，环境中的微生物隐藏在虾鳃以及内脏中，加工过程中简单地清洗不能将其去除，进而使其出现在产品中。虾肉和内脏与鳃的菌群组成结构相似，主要为嗜冷杆菌属，但虾肉中还有一定比例的不动杆菌属。虾肉中的主要微生物可能来源于其肠道，小龙虾在加工过程中造成肠道破裂，而虾肉中蛋白含量较高，有利于微生物生长，从而使内脏中的微生物转移到虾肉并逐步发展成优势菌。冷冻贮藏条件下，大部分微生物生命活动被抑制，经过4 ℃解冻使可以在低温条件下生长代谢的嗜冷杆菌属、不动杆菌属以及弧菌属复苏，并利用内脏与鳃和虾肉中的营养物质生长代谢，逐步占据优势，而这3 种菌属常见于低温贮藏产品中；调味汤料时常会被研究者们忽略，在冻藏-解冻期间，它的存在极大程度影响了样品整体pH值，进而影响微生物群落。调味汤料初始pH值较低，利于乳酸杆菌属代谢发育，并且真空包装条件下，细菌有氧代谢受到抑制，而乳酸杆菌可进行厌氧代谢，由于贮藏温度波动上升，乳酸杆菌属逐步在调味汤料中占据优势。虾壳中优势菌群较丰富，主要由弧菌属、乳酸杆菌属和嗜冷杆菌属组成。虾壳作为连接虾内部和外部的关键点，其微生物来源较广，包括内部内脏与鳃和虾肉中菌群的向外扩散、生长加工环境中微生物的污染以及调味汤料中微生物的向内扩散；其中弧菌属可能是由于小龙虾养殖环境的污染和加工清洗不完全，使得环境中或者内脏与鳃中的弧菌属附着在虾壳上，而弧菌属作为兼性厌氧菌可在真空包装条件下生存，且后续加工条件以及较低强度的杀菌不能将其消灭，进而使其出现在产品中。由于虾壳为小龙虾分隔内外的屏障，推测嗜冷杆菌属和乳酸杆菌属主要来源于内脏与鳃和调味汤料。

小龙虾的品种、生长环境、加工贮藏条件均会影响优势腐败菌菌相结构，因此熟制小龙虾制品在加工过程中，可结合超声波等物理技术对小龙虾进行多次复合清洗，降低初始菌落丰度；对于调味汤料，可以适当延长煮制时间或调整汤料酸度；低强度杀菌虽然可以保留小龙虾独特的风味，但具有一定局限性，可适当结合使用抑菌剂以及其他物理杀菌方法，进而在保证产品风味和质构的同时降低食用风险，延长货架期。本研究结果可为今后冷冻熟制小龙虾制品食用安全性和品质的提高提供理论依据。

作者简介

通信作者：

杨方，江南大学食品学院副教授，硕士生导师，国家大宗淡水鱼类产业技术体系加工研究室骨干成员，江苏大宗鱼类产业技术体系骨干成员，江苏水产加工技术创新联盟成员。主要从事食品加工技术，水产品加工、保鲜、质量安全检测方面的研究和教学工作。主持国家重点研发计划子课题、江苏省重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、江苏省自然科学基金项目等国家、省部级，校级和企业横向项目10余项，作为项目骨干参与项目10余项；在国内外核心学术期刊发表论文40余篇；申请国家发明专利20余项；获得教育部高校科学研究优秀成果奖科技进步奖二等奖。参与承担研究生课程《食品技术原理进展》，本科生课程《食品工艺学》、《食品新产品设计与开发》等。

第一作者：

公方朔，江南大学食品学院硕士研究生在读，主要从事熟制小龙虾加工与贮藏研究，参与“十三五”国家重点研发计划重点专项“长江中下游克氏原螯虾（小龙虾）全产业链食品质量安全保障技术集成与示范”子课题（2019YFC1606002），发表EI论文1篇。

本文《基于微生物指标评价冷冻熟制小龙虾食用安全风险》来源于《食品科学》2023年44卷第13期60-66页，作者：公方朔，陈一丹，杨方，姜启兴，许艳顺，夏文水。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220606-047。