人类的肠道菌群是一个由数万亿细菌组成的微生物生态系统。目前，抗生素参与疾病治疗的现象越来越普遍，在长期使用抗生素的过程中，有益菌大量流失，同时耐药的有害微生物数量不断增加，导致有害菌逐渐占据主导地位，最终导致患抗生素相关性腹泻及其他慢性疾病的风险急剧增加。
樟芝（Antrodia cinnamomea）又名牛樟芝、牛樟菇等，是一种珍稀的药食两用蕈菌，具有解酒保肝、抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗病毒、降血脂及调剂免疫等多种生物活性。近年来，研究者从樟芝子实体和发酵菌丝体中分离出200余种活性物质，其中，多糖是最主要的活性物质之一，具有较高的研发价值。
扬州大学食品科学与工程学院的李华祥，吉丹，杨振泉*等首先提取和纯化樟芝深层发酵所产胞内多糖（AIPS）及胞外多糖（AEPS），再对其进行组成分析及结构表征，最后探究其对抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群的调节作用。
用Sevag法经8 次脱蛋白处理后，检测樟芝多糖组成情况。由表1可知，AEPS和AIPS的总中性糖质量分数分别为82%和88%，蛋白质量分数均小于1.5%，纯度已足以用于小鼠实验。此外，AEPS和AIPS的主要组成单糖均为葡萄糖、半乳糖及甘露糖，但含量差异较大。其中，在葡萄糖相对含量方面，AEPS为84.73%，而AIPS为55.31%；在半乳糖相对含量方面，AEPS为7.84%，AIPS却高达28.52%；在甘露糖相对含量方面，AEPS为5.27%，AIPS高达14.34%。此外，AEPS中还含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，相对含量分别为0.76%和1.4%，而AIPS中则含有1.83%的氨基半乳糖。
樟芝多糖的分子质量分布结果如图1所示，AEPS主要由3 种不同分子质量的多糖组成，其中分子质量为1 013 kDa的多糖占比为77.96%，分子质量为233 kDa的多糖占比为18.04%，分子质量为28 743 kDa的多糖占比为3.99%。AEPS的平均分子质量为4.16×105 Da；AIPS主要由2 种不同分子质量的多糖组成，其中分子质量为12 452 kDa的多糖占比为49.54%，分子质量为1 623 kDa的多糖占比为50.46%。AIPS的平均分子质量为3.52×106 Da。可见，AEPS和AIPS在多糖组成上亦有着明显差异。
樟芝多糖红外光谱分析结果如图2 所示，在4 000～400 cm-1范围内，AEPS在3 400 cm-1左右有强而宽的吸收峰，这主要是由多糖中羟基的伸缩振动引起的；在1 673 cm-1左右有强而宽的吸收峰，这主要是由羰基（C＝O）的伸缩引起的，表明AEPS具有酰胺结构；在1 100 cm-1处有强而宽的吸收峰，这主要是由吡喃环结构的C—O键引起的，说明AEPS具有吡喃糖环；在944 cm-1处有强而宽的吸收峰，说明AEPS存在β-型糖苷键（图2A）。AIPS在3 276 cm-1左右有强而宽的吸收峰，这主要是由多糖羟基中分子间的氢键伸缩振动引起的；在3 000 cm-1左右有吸收峰，这主要是由—CH—键引起的，表明AIPS具有—C≡C—H结构；在1 642 cm-1左右存在强吸收峰，表明AIPS存在酰胺结构；在1 074 cm-1和1 047 cm-1处存在强吸收峰，表明AIPS存在C—O结构（图2B）。
建立体外消化模型，对樟芝多糖的抗消化能力进行测定，结果如图3所示。AEPS在α-淀粉酶的作用下，水解度随着时间的延长而增加，在150 min后水解度变化不明显，约为0.02%（图3A）。AEPS在不同pH值的胃模拟液中水解度也较低，在不同pH值条件下的水解度都会随着时间的延长而增加（图3B），其中在pH 2.0条件下水解度最高，210 min时约为0.05%，AEPS在pH 3.0胃模拟液中的水解度高于pH 4.0胃模拟液中的水解度。此外，AIPS在α-淀粉酶的作用下，180 min时的水解度为0.028%（图3C）。AIPS在不同pH值的胃模拟液中水解度较AEPS高，AIPS同样也在pH 2.0的胃模拟液中水解度最高，210 min时为0.064%（图3D）。上述结果表明，AEPS及AIPS均具有较强的抗消化能力，即若口服樟芝多糖，其可顺利进入肠道并发挥作用。
5 樟芝多糖对抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群的调节作用
如图4所示，不同LIH剂量组小鼠停药后4 d内的状态和表现差异较为明显。灌胃2.7 g/kg mb LIH的小鼠毛发状态与正常对照组相比没有明显的变化，均较为平滑；此外，小鼠活动正常，摄食量与正常对照组相比无明显差异。灌胃3.7 g/kg mb LIH的小鼠出现轻微的脱毛现象，并且活动迟缓、毛发粗糙、食欲减退，摄食量与正常对照组相比明显减少；灌胃4.2 g/kg mb LIH的小鼠出现多处大面积的脱毛现象，行为活动迟缓、烦躁少动、食欲不振，几乎不摄食。此外，从小鼠粪便形态来看，灌胃2.7 g/kg mb LIH的小鼠出现轻微腹泻，并在停药1 d后即完全恢复正常；灌胃3.7 g/kg mb LIH的小鼠粪便稀软、不成形，呈烂泥状，表现为中度腹泻，并在停药4 d后恢复正常；灌胃4.2 g/kg mb LIH的小鼠粪便稀溏，稀薄如水，呈现水样便，表现为严重腹泻，并在停药4 d后仍持续腹泻。综上所述，最终选择3.7 g/kg mb作为后续小鼠建模的LIH给药剂量。
肠道菌群多样性分析
为了解各组小鼠体内肠道菌群的物种丰富度和均一性，首先对小鼠肠道菌群测序结果进行α-多样性分析，结果如图5所示。RG组小鼠肠道菌群的多样性明显低于NC组，说明LIH严重破坏了小鼠体内的肠道菌群平衡，并抑制或杀死了大量微生物；同时，灌胃AEPS、AIPS及FOS（低聚果糖）均有助于调节和恢复小鼠肠道菌群的多样性，且AEPS的效果优于AIPS和FOS。 
为了比较不同处理组间小鼠肠道菌群结构的差异，对测序结果进行了β-多样性分析（主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度（NMDS）分析）（图6）。结果表明，不同处理组之间的小鼠肠道菌群结构均具有明显差异，说明灌胃LIH、AEPS、AIPS及FOS均对小鼠肠道菌群结构产生了较为明显的影响，也说明樟芝多糖对小鼠肠道菌群多样性具有明显的调节作用。此外，从各组中重复样本间的距离来看，各组重复样本均较为集中，说明各重复样本的差异较小，重复性较好。 
肠道菌群结构分析
绘制各组小鼠肠道菌群在门水平、科水平及属水平上丰度排名前10的微生物相对丰度柱形图。结果表明，从门水平来看，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和变形菌门（Proteobacteria）为主要的优势菌群，所占的比例约为总菌群的95%（图7A）。此外，在变形菌门的占比上，NC组明显低于RG、AEPS、AIPS及FOS组，但在拟杆菌门的占比上，NC组明显高于RG、AEPS、AIPS及FOS组；厚壁菌门在各处理组小鼠肠道中的相对丰度较低，但与NC组相比，AEPS组中厚壁菌门的相对丰度大幅增加（图8A）。
从科水平来看，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）及疣微菌科（Ruminococcaceae）为主要的优势菌群，所占的比例约为总菌群的80%（图7B）。乳酸杆菌是益生菌群，AEPS组中乳酸杆菌科的相对丰度明显高于NC、RG及AIPS组（图8B），表明灌胃AEPS可以大幅提升小鼠肠道内乳酸杆菌科的相对丰度；肠杆菌科在RG及AIPS组中的相对丰度明显高于NC、AEPS及FOS组。从图8B中可看出，灌胃AIPS后，小鼠肠道内Staphylococcaceae的相对丰度较NC及RG组急剧上升，这一现象在AEPS及FOS组中均未出现，而Staphylococcaceae为有害菌。此外，AIPS组中Ruminococcaceae的相对丰度较其他组明显增加，而Ruminococcaceae亦为有害菌。从属水平来看，假丝酵母菌属（Candidatus_Saccharimonas）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳酸菌属（Lactobacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）及假单胞菌属（Pseudomonas）为主要优势菌群（图7C、8C）。 为了进一步分析不同组间小鼠肠道菌群相对丰度差异较大的微生物物种，选取微生物相对丰度排名前35 的属，根据其在每个组中的丰度信息，从物种和样本两个层面进行聚类，绘制成热图。如图9 所示，另枝菌属（Alistipes）、拟杆菌属（Bacteroides）、副杆菌属（Parabacteroides）、丹毒杆菌属（Erysipelatoclostridium）、普拉梭菌属（Faecalibacterium）、肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）及乳酸菌属（Lactobacillus）等为主要菌群，且在不同组中的相对丰度差异明显。
此外，从图9中可以看出，与NC、AEPS、AIPS及FOS组相比，RG组小鼠肠道中Parasutterella、Thiomonas、Thiobacillus、Bacillus等菌属的相对丰度明显增加。与AEPS及FOS组相比，AIPS组小鼠肠道菌群中Enterococcus及Staphylococcus的相对丰度明显增加，而Enterococcus和Staphylococcus的相对丰度与炎症程度呈正相关。此外，在AEPS和FOS组中，Lactobacillus的相对丰度较RG及AIPS组明显增高，而Lactobacillus对肠道疾病有治疗作用，能减轻高浓度抗生素引起的腹泻症状。
多数真菌多糖具有与益生元相似的功能，能通过刺激特定肠道菌群的生长或活性而使宿主受益。这是因为大多数真菌多糖属于β-葡聚糖类，对胃及肠道中的消化酶具有较强的抵抗性，通常是不可被消化的。本研究中体外消化模拟实验结果表明，AEPS及AIPS均呈现出较强的抗消化能力。
真菌多糖相比较菊粉、低聚果糖等益生元更能促进有益菌（如双歧杆菌和乳酸杆菌等）的生长。樟芝作为一种新兴的珍贵药食两用真菌，其多糖具有抗氧化、抗炎症、抗病毒及调节免疫等多种生物活性，在益生元方面亦具有较大的研究价值及开发潜力。
本研究结果表明，AEPS和FOS的摄入会显著增加小鼠肠道中Lactobacillus相对丰度（P＜0.05），且AEPS组中志贺氏菌属（Shigella）相对丰度明显低于AIPS组（图7C）。益生菌乳酸菌属（Lactobacillus）是人类胃肠道中最丰富的微生物之一，与良好的肠道健康有关。
在AIPS组中，Staphylococcus的相对丰度明显高于AEPS、FOS及RG组。而Staphylococcus是医院感染和术后感染中常见的微生物，它被认为是引发抗生素相关性腹泻最常见的原因之一。从图7C可以看出，AEPS组中Lactobacillus的相对丰度明显高于RG组（P＜0.05），说明AEPS可明显降低Staphylococcus的相对丰度，从而缓解腹泻症状及肠道损伤。
从图9可以看出，Parasutterella在RG组中的相对丰度最高。Parasutterella是来自变形杆菌门的一种革兰氏阴性、严格厌氧的球菌属。有报道称，肠道内Parasutterella相对丰度的增加会导致胃肠道生态失调及肠道菌群多样性的降低，进而引发肠道疾病或代谢疾病，如炎症性肠病和肥胖。同时，在AIPS组中，Enterococcus的相对丰度较高，而大鼠结肠炎与Enterococcus丰度之间存在正相关性。 AEPS及AIPS经过8 次Sevag法脱蛋白处理后，蛋白质量分数均低于1.5%，总中性糖质量分数分别约为83%及89%，纯度较高；采用HPLC法分析樟芝多糖（AEPS及AIPS）的单糖组成，结果表明AEPS主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸组成，相对含量分别为7.84%、84.73%、5.27%、0.76%及1.40%；而AIPS主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖组成，相对含量分别为28.52%、55.31%、14.34%及1.83%；采用HPGFC法分析樟芝多糖的分子质量分布，发现AEPS的平均分子质量为4.16×105 Da，AIPS的平均分子质量为3.52×106 Da，二者之间存在明显差异；分析樟芝多糖在4 000～400 cm-1范围内红外光谱发现，AEPS具有吡喃糖环，且存在β-型糖苷键；而AIPS具有酰胺结构，且存在（—C≡C—H）、C—O官能团；体外模拟消化实验结果表明，AEPS及AIPS均具有较强的抗消化能，表明口服樟芝多糖后，其可顺利进入肠道并发挥作用；小鼠体内实验结果表明，灌胃AEPS可大幅增加小鼠肠道菌群中的部分有益微生物（如Lactobacillus）的相对丰度，同时明显降低小鼠肠道菌群中部分有害微生物（如Enterococcus、Staphylococcus、Parasutterella及Shigella）的相对丰度。其中，AEPS对小鼠肠道菌群的调节效果明显优于AIPS。
杨振泉，扬州大学食品科学与工程学院教授，博士生导师，主要研究方向为功能乳酸菌发掘及其在有害生物因子生态防控中的应用及食品生物有害因子快速检测技术与应用。曾获全国商业科技进步一等奖、教育部科技进步一等奖、中华农业科技进步二等奖、扬州大学教学成果一等奖等，主持国家级项目5项，省基项目8项，发表SCI论文50余篇，获授权20余项。第一作者：
李华祥，扬州大学食品科学与工程学院讲师，食品生物技术教研室副主任。2017年6月，博士毕业于江南大学生物工程学院发酵工程专业，2018年5月入职扬州大学食品科学与工程学院。长期从事牛樟芝相关研究，精通丝状真菌发酵及活性物质分离。目前主要从事真菌发酵及食品质量安全与控制研究。主持国家青年自然科学基金项目和江苏省青年自然科学基金项目各1项，已发表学术论文近30篇，其中SCI论文近20篇，获授权专利7项。
本文《樟芝深层发酵多糖对抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群的调节作用》来源于《食品科学》2023年44卷第13期42-51页，作者：李华祥，吉 丹，陆春雷，叶青雅，赵灵惠，高亚军，高 璐，杨振泉。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220728-320。
