食品界

FSHW | 自组装食物源蛋白封装二十二碳六烯酸（DHA）：提高稳定性及实现高效的生物功能

Introduction

二十二碳六烯酸（DHA，22n-6）是一种重要的n-3多不饱和脂肪酸，对身体健康和神经发育至关重要，被世界卫生组织和多个国家的饮食指南推荐每天摄入。然而，DHA在水性介质中溶解度极低，对加工和储存条件（如光、热和氧气）高度敏感，这些极大限制了DHA生物活性。

针对这一问题，许多纳米及微米级递送系统应运而生，通过封装DHA达到提高DHA生物利用度的作用。其中，单分散纳米载体（1～1000 nm）可以提高治疗剂和生物活化剂的渗透率，相比于微米级载体，具有更出色的物理和化学性能。

自组装是一种通过各种交互将多种组件自主组织成模式或结构的形式，是构建纳米结构的重要方式，在构建不同尺度的组织方面显示出巨大的优势。纳米胶束是临床试验中使用的最先进的纳米晶体，是包含亲水段和疏水段的接枝共聚物。胶束在水等极性溶剂可以中自组装成具有核壳结构的圆形排列，以内部疏水核心和外部亲水环境定向，实现疏水药物包埋。

蛋白质具有毒性小，抗氧化稳定性高的优点，是保护敏感功能性物质的有效载体。但是容易发生聚集或沉淀产生毒性。通过酶水可以将蛋白质大分子分解成小片段实现克服沉淀的目的，也有利于跨膜吸收。胰凝乳蛋白酶能够特异性切割蛋白质分子的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等疏水氨基末端。卵清蛋白（O）、肌球蛋白（M）、7S大豆球蛋白（S）和β-乳球蛋白（β）是日常饮食摄入的主要两亲性蛋白。O、M、S和β被胰凝乳蛋白酶水解，自组装成具有亲水冠和疏水核心的生物相容性天然多肽，并嵌入DHA。

沈阳农业大学食品学院刘语萌博士研究生及导师乌日娜教授、武俊瑞教授等在本文以DHA和卵清蛋白（O）、肌球蛋白（M）、7S大豆球蛋白（S）和β-乳球蛋白（β）四种不同食物来源的两亲性蛋白质作为研究对象，测定了酶解蛋白封装DHA的物理、化学和生物特性；提出了一种可以用于保护敏感性疏水活性物质的递送体系；系统探索蛋白胶束封装对DHA功能特性的影响；为疏水功能化合物的开发和应用奠定基础。

Results and Discussion

确定DHA分别嵌入O、M、S和β胶束

DHA与O、M、S和β胶束之间的相互作用表明，O、M、S和β结合位点的荧光强度随着DHA浓度的增加而逐渐下降（图1）。这是由于胶束的疏水核心含有越来越多的DHA，导致蛋白质的内源性荧光猝灭，表明O、M、S和β胶束自组装，DHA成功嵌入蛋白质胶束的内核。

图1 O、M、S和β胶胶束分别封装不同浓度DHA的荧光光谱

透射电镜（TEM）观察负载DHA的O、M、S和β胶束

两亲性O、M、S和β被胰凝乳蛋白酶水解，自组装成具有亲水冠和疏水核心的生物相容性天然多肽后嵌入DHA。使用TEM观察O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）的表面形态和分布（图2）。发现O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）是均匀单分散的球形纳米球。

图2 TEM观察图像

O、M、S和β胶束提高DHA空间稳定性

与游离DHA相比，嵌入DHA的O、M、S和β胶束表观ZP的绝对值显着增加（P＜0.01）。表明胶束有助于建立相对稳定的系统，因此可以延长嵌入 DHA 的保质期。胶束的负电荷和带正电荷的DHA之间的静电相互作用允许形成核壳纳米颗粒，并提高负载效率。动态光散射显示载入DHA的O、M、S和β胶束粒径增加，表明掺入胶束内部疏水核心载入DHA导致体积增加。

表1 电位和粒径

O、M、S和β胶束提高提高DHA的水溶性和贮藏稳定性

如图3A所示，DHA几乎不溶于水，负载等量DHA的O、M、S和β胶束可溶于水。随着浓度的增加，DHA在水中的溶解度保持接近于零，表明水溶性较差，O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）中可溶性DHA的含量随着DHA的增加而增加，表明胶束包封可以提高DHA的水溶性（图3B）。在50 °C或在波长为254 nm的紫外光下长达20 h测量嵌入DHA的O、M、S和β胶束中剩余DHA的比率。在50 °C加热18 h后，DHA基本不存在，但在20 h后，DHA在O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）中的保留率保持≥50%（图3C）。图3D显示，在紫外线照射16 h后，剩余DHA减少到零，在20 h后O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）中的DHA残留率超过40%。这归因于胶束和DHA之间的非共价键合，这使得胶束能够保护DHA，从而提高稳定性。

图3 DHA的溶解度和残留百分比

负载DHA的O、M、S和β胶束的细胞摄取

Caco-2细胞核和DHA分别用蓝色疏水性Hoechst 33342和红色NR染色。Caco-2细胞对DHA的摄取显着高于DHA（图4A）。流式细胞仪检测结果表明，负载在O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）中的NR发出的红色荧光强度比Caco-2细胞质中的DHA更强。与CLSM 观察的细胞摄取结果一致，表明O、M、S和β胶束将大大提高细胞DHA吸收的效率。DHA可以通过膜转运蛋白介导的主动转运吸收进入细胞，转运效率较低。O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）表面的肽是大分子，通过吞噬作用穿过细胞单层，可以同时运输大量物质。因此，嵌入在O、M、S和β胶束中的DHA的细胞摄取显着增加，提高生物利用度。

图4 Caco-2细胞摄取

负载DHA的O、M、S和β胶束的自噬体形态

用MDC标记的自噬体在CLSM下显示为亮绿色点。当单独与H₂O₂孵育1 h时，绿色斑点的数量增加（图5）。与DHA、O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）共孵育4 h后，斑点减少，与DHA相比，O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）减少的量显着增加。这些结果进一步证实了O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）在更大程度上降低了Caco-2细胞中氧化应激诱导的细胞自噬。

图5 Caco-2细胞自噬体形态

增强负载DHA的O、M、S和β胶束的细胞抗氧化活性

与未处理的细胞相比，用H₂O₂孵育的细胞中GSH-Px活性显着降低（P＜0.05），ROS显著升高。与DHA、O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）孵育的Caco-2细胞中GSH-Px活性显著升高，ROS显著降低，且O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）孵育后的活性高于DHA，ROS低于DHA。这可能归因于蛋白质纳米胶束增加了DHA的细胞摄取，从而提高了其抗氧化能力。

HepG2细胞验证细胞摄取

与CLSM对Caco-2细胞摄取的观察结果一致，HepG2细胞对O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）的DHA摄取显着高于DHA。NR加载在O（DHA）、M（DHA）、S（DHA）和β（DHA）中发出的红色荧光显著高于等效浓度的DHA。

第一作者

刘语萌，中共党员，沈阳农业大学食品科学与工程2020级在读博士研究生，主要研究方向为食品功能性物质的提取及生物活性鉴定、纳米递送体系的研发和细胞免疫学技术，在国内外期刊公开发表多篇学术论文，其中第一或共一作者发表SCI收录文章4篇，总影响因子23.623，多次参加学术研讨会议，并荣获沈阳农业大学学业奖学金，第五届研究生“职等你来”模拟面试比赛三等奖，第二届东北地区研究型学术论坛-学术汇报优秀奖，第七届中国国际“互联网+”大赛沈阳农业大学选拔赛三等奖。

通信作者

乌日娜，教授，博士生导师，博士后合作导师，辽宁省食品发酵技术工程研究中心主任，全国百篇优秀博士论文提名论文获得者，江南大学食品科学与技术国家重点实验室、国家功能食品工程技术研究中心博士后，食品安全与营养协同创新中心“乳制品创新平台”岗位专家，入选辽宁省百千万人才工程百人、辽宁省首批“兴辽英才”、辽宁省农业领域青年科技创新人才、辽宁省高等学校优秀人才、沈阳市高层次领军人才、沈阳市中青年科技创新人才、天柱山学者等。兼任国家食药同源科技创新联盟常务理事兼发酵专委会副会长、中国食品科学技术学会传统酿造食品分会常务理事、中国食品科学技术学会特殊食品分会常务理事，中国农学会农产品贮藏加工分会、中国食品科学技术学会、中国畜牧兽医学会微生态分会理事，《Frontiers in Microbiology》客座主编，《中国微生态学杂志》、《食品研究与开发》、《中国酿造》、《乳业科学与技术》等杂志编委。

主持国家自然科学基金项目课题4项，区域联合基金项目课题1项，其他项目20余项，参加国家863重大项目、国家“十二五”科技支撑、国家星火计划重大项目、国家自然科学基金等课题30余项。研究成果荣获全国百篇优秀博士论文提名论文奖、全国食品工业科技进步特等奖、全国商业联合会科技进步二等奖、全国食品科技创新二等奖、辽宁省科技进步二等奖等多项奖励。申请国家专利62件，已授权27件。发表科研论文200余篇，其中SCI收录101篇。编著专著和教材16部，其中，英文专著2部。

通信作者

武俊瑞，博士，教授，博士生导师，荷兰瓦赫宁根大学访问学者，辽宁省食品发酵技术工程研究中心常务副主任，沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室主任，方向带头人，辽宁省百千万人才工程千人、辽宁省创新人才、辽宁省杰出青年学者成长计划、沈阳市中青年科技创新领军人才、沈阳市高层次拔尖人才、辽宁省科技特派员、天柱山英才等。主要研究方向为益生菌、乳制品和发酵食品方面的研究。

兼任中科院沈阳转移中心科技顾问、大连理工大学特聘研究员、国家食药同源联盟理事兼发酵专委会委员、中国肠微生态-疾病整合联盟科技顾问、中国微生物学会酿造分会专委会委员、全国无抗产业科技创新联盟常务理事，中国食品科学技术学会、中国农学会农产品贮藏加工分会、中国功能性食品产业联盟、中国微米纳米学会理事，国家林业与草原局教材评审委员会专家等，《Frontiers in Nutrition》、《iMeta》、《The Open Microbiology Journal》、《中国微生态学杂志》、《乳业科学与技术》等杂志编委。

主持国家自然科学基金面上项目3项，主持其他项目30余项；参加国家863、十二五、十三五、国家星火计划重大项目、国家综改办项目等课题40余项。发表论文 150余篇，其中，SCI收录论文66篇。3篇ESI高被引论文，1篇入选2015—2019年“领跑者5000——中国精品科技期刊顶尖学术论文”。申请国家专利51件，已授权23件。主编、副主编教材和著作16部。

研究成果获中国食品工业科学技术特等奖、农业部神农中华农业科技奖、全国商业科技进步二等奖2项、辽宁省自然科学奖、辽宁省科技进步二等奖、山东省科技进步二等奖、齐鲁农业科技二等奖等多项奖励。

Encapsulation of docosahexaenoic acid (DHA) using self-assembling food-derived proteins for efficient biological functions

Yumeng Liu^a,b, Kaixin Cao^a,b, Tong Li^a, Delun Mu^a,c, Naiqi Zhang^a,b, Ying Wang^a,b, Rina Wu^a,b,c,*, Junrui Wu^a,b,c,*

^a College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

^b Liaoning Engineering Research Center of Food Fermentation Technology, Shenyang 110161, China

^cShenyang Key Laboratory of Microbial Fermentation Technology Innovation, Shenyang 110866, China

¹ Both authors contributed equally.

*Corresponding authors.

Abstract

Docosahexaenoic acid (DHA; 22n-6) possesses multiple biological functions, including antioxidant activity and ameliorating hypertriglyceridemia. However, the application of DHA has been limited due to poor aqueous solubility and susceptible to oxidation. Here, ovalbumin (O), myosin (M), 7S soy globulin (S), and β-lactoglobulin (β), hydrolyzed by chymotrypsin, self-assembled into micelles, respectively. Adding incremental DHA to micelles caused endogenous fluorescence quenching of O, M, S, and β micelles, implying successful incorporation of DHA into hydrophobic cores of micelles (O (DHA), M (DHA), S (DHA), and β (DHA)). The results showed that micelles provided spatial stability and improved solubility, and stability against thermal and ultraviolet (UV) light for DHA. The uptake of DHA from M (DHA), β (DHA), O (DHA), and S (DHA) was 3.27-, 3.91-, 2.7-, and 3.95-fold higher, respectively, than that of DHA by Caco-2 cells. Encapsulation in micelles increased DHA aqueous solubility and uptake, which enhanced cellular endogenous antioxidant defense. Meanwhile, increased uptake of DHA was verified by HepG2 cells, and O, M, S, and β micelles were proven to increase DHA uptake to reduce lipid deposition. Our findings strongly support the possibility that O, M, S, and β micelles can be regarded as a carrier for loading DHA.

Reference:

LIU Y M, CAO K X, LI T, et al. Encapsulation of docosahexaenoic acid (DHA) using self-assembling food-derived proteins for efficient biological functions[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1861-1871. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.038.