上海海洋大学谢晶教授等：生物被膜初始黏附调控机制及其在食品品质控制中的应用研究进展
2023-10-17作者：来源：责任编辑：食品界
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细菌是影响食品品质的主要因素，其通过自身代谢作用，产生初级或次级代谢产物，使得食品基质发生劣变，形成挥发性有机物等有害物质，进而影响食品风味和食品安全性，导致食品安全问题的发生。生物被膜的生命周期分为4 个阶段：初始黏附、微菌落形成、生物被膜成熟和生物被膜降解。初始黏附是浮游态细菌通过细菌表面元器件、胞外聚合物（EPS）等作用与物体表面产生一系列理化作用并吸附到生物或非生物表面的过程。细菌初始黏附受到多种因素的影响，其中细菌细胞内的调控系统是影响其初始黏附的重要因素。
上海海洋大学熊儒恒、阎俊和谢晶*阐述并分析了环二鸟苷酸（c-di-GMP）、双组分调控系统和群体感应系统3 种调控系统（图1）对细菌初始黏附的调控作用及其作用机制，并对从控制初始黏附角度进行食品品质控制的应用进行了总结和展望。本文可为控制细菌造成的食品品质危害提供一定的理论依据，有助于生物被膜靶向控制技术的开发，对食品产业的发展具有一定意义。 
c-di-GMP是在1987年于木糖醋杆菌（Acetobacter xylinum）中首次发现的一种化合物。c-di-GMP的合成和降解分别在二鸟苷酸环化酶（DGC）和磷酸二酯酶（PDE）的催化作用下进行，编码DGC和PDE的基因在细菌细胞中广泛存在。光照、氧气和温度等外界环境条件可通过调控DGC和PDE编码基因的表达来调节细菌细胞中DGC和PDE的表达水平，进而影响细菌体内c-di-GMP的含量。细菌体内c-di-GMP含量的变化对调节细菌生理代谢有十分重要的作用。一般情况下，细菌细胞内c-di-GMP含量较高时，细菌倾向于生物被膜态；当细菌细胞内c-di-GMP含量较低时，细菌倾向于浮游态。 c-di-GMP调控细菌下游表型的方式分为3 种：c-di-GMP作为核糖开关，结合mRNA在核糖体上的结合位点，调节mRNA的转录和翻译；c-di-GMP的受体蛋白为转录因子，与转录因子结合，调控转录因子对基因转录的调控能力，从而调控下游靶基因的表达；c-di-GMP的受体蛋白为激活/阻遏蛋白，与受体蛋白结合，通过调控靶蛋白的活性来影响细菌生命活动。在细菌初始黏附阶段，c-di-GMP先通过调节细菌元器件如鞭毛的合成、控制鞭毛转动速度等调节细菌菌体接触外界固体表面，并选择性调节EPS组分如胞外蛋白和胞外多糖的合成和分泌基因的表达，促进细菌细胞黏附在外界固体表面。c-di-GMP能够调控多数EPS组分的合成和分泌，这是其调控细菌初始黏附的重要方式。 c-di-GMP对胞外多糖的影响
胞外多糖是EPS的重要组成部分。细菌能产生多种形式的胞外多糖，常见的有纤维素、聚-N-乙酰葡萄糖胺、海藻酸盐、Psl多糖和Pel多糖等。其中，c-di-GMP通过调控Pel和Psl多糖的合成和分泌来调控细菌初始黏附作用受到了研究人员的广泛关注。 Pel是一种阳离子胞外多糖，它的合成和转运由pelA～G操纵子编码的蛋白质负责。Pel多糖的合成和转运过程如图2A所示，c-di-GMP能通过多种方式影响细菌胞外多糖Pel的合成和转运，进而调控细菌的初始黏附。c-di-GMP对Pel多糖的直接调控体现在对Pel多糖合成基因pelD转录产物的调控上。 与Pel不同的是，Psl是一种中性的细菌胞外多糖。Psl的合成和转运由Psl胞外多糖生物合成系统负责，该系统是一个包含12 个基因（pslA～L）的psl操纵子，Psl胞外多糖的合成和转运如图2B所示。Psl有助于增强细菌黏附作用，促进细菌附着于宿主细胞表面。此外，Psl能够通过增强细胞黏附作用增加细菌毒性，对菌株有一定的保护作用。 c-di-GMP对胞外蛋白的影响
黏附蛋白是细菌胞外蛋白的组分之一，c-di-GMP不仅影响细菌胞外多糖的合成和分泌，也能调控细菌黏附蛋白的合成，并通过影响胞外蛋白的黏附作用调控细菌的初始黏附。目前，研究人员已在不同的菌种中发现多种黏附蛋白，其中，c-di-GMP调控BpfA和LapA蛋白并影响细菌初始黏附的作用机理是研究人员关注的热点。
BpfA 蛋白最初是在奥奈达希瓦氏菌M R-1（Shewanella oneidensis MR-1）中发现的，该蛋白的分子质量为285 kDa，是一种非常大的蛋白，并由bpfa基因（SO4317）编码，通过I型蛋白质分泌系统（TISS）分泌，它是细菌进行初始黏附和维持成熟生物被膜结构所必需的。细菌细胞内c-di-GMP水平的变化会影响细菌BpfA蛋白的含量。c-di-GMP可根据其在细菌细胞内的含量变化，调控BpfA在细菌细胞表面的含量（图3A）。当细菌细胞内c-di-GMP水平较高时（图3A中a），c-di-GMP可以激活c-di-GMP结合蛋白BpfD并形成复合物，该复合物能结合周质蛋白酶BpfG，从而阻止BpfG水解BpfA蛋白，帮助细菌完成初始黏附并形成生物被膜。但当细胞内c-di-GMP水平较低时（图3A中b），BpfG的抑制作用被解除，BpfA在BpfG的水解作用下从细胞表面释放，细菌的黏附作用被大幅降低。而在环磷酸腺苷（cAMP）存在的情况下（图3A中c），低浓度的c-di-GMP可以和cAMP以及cAMP受体蛋白（CRP）相互作用，协同维持BpfD和BpfG之间的相互作用，防止BpfA蛋白被BpfG水解；只有当细菌细胞内c-di-GMP水平低到一定程度，不足以和cAMP发挥协同作用时（图3A中d），BpfG蛋白才会发挥正常作用。LapA蛋白是一种在铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）中发现的黏附蛋白，其也可以通过TISS分泌到细胞表面并发挥黏附作用。与BpfA相比，c-di-GMP对LapA蛋白的调控机理较为简单（图3B）。LapA的分泌受到LapE、LapD和LapG等蛋白的调控。LapD是一种c-di-GMP受体，当细菌细胞内c-di-GMP含量较高时（图3B中a），LapD可以与c-di-GMP结合形成复合物，该复合物能与周质蛋白酶LapG相互作用，阻止LapG切割LapA的N-端区域，使LapA可留在细胞表面，增强细菌细胞的黏附作用；当细菌细胞内c-di-GMP含量较低时（图3B中b）。细菌细胞内c-di-GMP的水平并不直接影响LapA的合成和分泌，但是能通过调控LapD蛋白与周质蛋白酶LapG的结合作用，影响LapG对LapA的水解，进而影响细菌细胞外膜表面LapA的含量，这也是c-di-GMP调控细菌初始黏附作用的一种有效方式。 除此之外，c-di-GMP还可以通过调节细菌鞭毛结合蛋白与鞭毛组分的相互作用以及鞭毛蛋白的合成等作用，影响细菌初始黏附。 双组分调控系统是细菌细胞中一种常见的调控系统（图1B），该系统主要由组氨酸激酶（HK）和应答调节蛋白（RR）组成，并通过磷酸化作用进行信号转导。双组分调控系统是细菌感知外界环境并调控细胞生理活动的重要方式之一。细菌细胞能通过双组分调控系统对环境信号如营养、氧气浓度、渗透压等做出响应，并调节自身活动以适应环境变化。不同的双组分调控系统能响应的外界信号类型不同，且细菌同一种生命活动受多种双组分调控系统影响。
ArlS/ArlR是较为典型的双组分调控系统，该系统于2000年在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中发现。研究证实，双组分调控系统ArlS/ArlR可以通过影响细菌分泌的肽聚糖水解酶活性来控制细菌对聚合物表面的附着。细菌EPS中其他大分子表面蛋白会对黏附蛋白的黏附行为产生干扰作用，ArlRS-MgrA能通过解除这种干扰作用来增强黏附蛋白的黏附作用（图4）。细菌通过功能性ArlRS-MgrA的级联作用抑制大分子表面蛋白如Ebh、SraP、SasG等的活性，并增强细菌黏附因子与配体的结合，从而增强细菌初始黏附作用（图4A）。当ArlRS-MgrA级联作用失活时，Ebh、SraP和SasG会出现在细菌细胞表面并阻止相邻的黏附因子与其配体结合，从而大幅抑制细菌的初始黏附作用（图4B）。需要注意的是，ArlS/ArlR系统通过解除细菌初始黏附的抑制作用，间接增强细菌的初始黏附作用，这为研究特异性的细菌调控系统调控细菌初始黏附作用提供了新的思路。 双组分调控系统可以单独调控细菌多种生命活动，也可以与其他生物大分子共同发挥调控作用。SagS是在铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）中发现的一种杂合HK。与普通双组分调控系统不同的是，SagS不仅具有HK的保守蛋白结构，还能编码类似反应调节蛋白的结构。研究表明，SagS可以和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）中的调控系统Gac/Rsm以及双组分调控系统BfisR相互作用，共同调控细菌的初始黏附以及生物被膜的发育和成熟。此外，SagS与第二信使c-di-GMP的级联效应也是铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）调节初始黏附作用的一种重要方式。与其他双组分调控系统不同的是，SagS系统并不是根据外部信号直接调控细菌的初始黏附，而是作为中转信号调控细菌c-di-GMP，由c-di-GMP含量的变化调节细菌初始黏附等生命活动。这种调控方式与普通的双组分调控系统和c-di-GMP调控系统相比更为复杂，涉及到细菌细胞内更多的生命活动，但也拓宽了不同调控系统的调控范围，增加了各系统调控功能间的关联性，有利于细菌适应不同的外部环境。 双组分调控系统可以同时调控包括细菌初始黏附在内的多种生命活动，如在单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）中，LisRK双组分调控系统可以同时调控细菌的抗生素抗性和初始黏附作用，在无LisRK系统的调控下，单增李斯特菌的抗药性大幅降低，同时，细菌初始黏附作用也较野生菌株有所减弱。双组分调控系统的存在使得细菌应对复杂多变外界环境的能力大幅提高。与其他调控系统相比，双组分调控系统调控方式多样，调控行为复杂，且与其他调控系统有不同程度的相互作用，目前的研究还未能完全阐明双组分调控系统的具体调控路径，且该系统与其他生物大分子和调控系统的相互作用也需要进一步研究。 群体感应系统是研究人员先后在肺炎链球菌（Stretococcus pneumonia）和费氏弧菌（Vibrio fischeri）中发现的。细菌细胞向培养环境中释放群体感应信号分子至一定浓度时，群体感应信号分子与细胞上的受体结合，调节细菌中相关基因的表达，从而调控细菌生命活动（图1C）。细菌群体感应信号分子主要分为3 类：革兰氏阴性菌中的N-酰化高丝氨酸内酯类（AHLs）、革兰氏阳性菌中的自诱导肽类（AIPs）以及革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间的自诱导子-2类（AI-2）。 基于AHLs的群体感应系统主要包括AHLs信号分子、AHLs合成酶和AHLs受体3 个部分。AHLs经AHLs合成酶（LuxI）合成后，被分泌到细菌细胞外并积累；当AHLs浓度随着细菌细胞密度的提高而增加到一定程度后，AHLs信号分子将结合并激活受体蛋白（LuxR）形成AHLs-LuxR蛋白复合体，调控目标基因转录，从而达到影响细菌生命活动的目的。 以AHLs为代表的群体感应分子在浓度低时并不能直接调控细菌的初始黏附作用，增加细菌胞外多糖和胞外蛋白的含量，并增强细菌黏附作用，这是细菌应对环境变化的一种有效方式。AHLs通过上调EPS编码基因的表达，增加EPS的含量，加快细菌黏附作用和生物被膜的形成，是调控细菌生物被膜形成的重要的方式。在一定浓度范围内，随着外源AHLs信号分子浓度的增加，细菌初始黏附作用强度也得到不同程度的增强。细菌生物被膜形成的强度与细菌初始黏附作用也表现出一致性，当外源性AHLs对细菌初始黏附作用的影响降低时，细菌生物被膜形成的强度也随之降低。 AI-2常与LuxS蛋白一同构成群体感应系统，且AI-2类群体感应信号分子的合成在luxS基因的转录产物LuxS蛋白的协作下完成，AI-2类群体感应系统已在多种细菌中被发现，同时luxS基因是一种高同源性基因，不同细菌分泌的AI-2信号分子结构相似，这使得AI-2的应用范围更为广泛。 一般情况下，当菌体密度低、A I-2 水平低时（图5A），LuxQ在LuxQ感应激酶的作用下发生自磷酸化作用，磷酸基团经过磷酸转移蛋白LuxU被转移至调节蛋白LuxO，LuxO-P激活细菌细胞内小分子核糖核酸（sRNAs）的转录，sRNAs和sRNAs伴侣蛋白Hfq结合，促使luxR无法正常转录；当菌体密度高、AI-2水平高时（图5B），AI-2与受体蛋白LuxP结合，并通过LuxQ导致LuxO去磷酸化失去活性，使LuxR蛋白得到正常合成，调控下游基因正常转录。 AI-2信号系统和AHLs类似，对细菌初始黏附和其他生命活动等都有一定的调控作用，是研究细菌黏附作用不可忽视的调控系统。4 初始黏附机制在食品品质控制中的应用
细菌初始黏附作用发生在生物被膜成熟之前，因此，在细菌处于初始黏附阶段时，通过生化等方法抑制细菌的初始黏附能够有效抑制细菌生物被膜的形成，对降低因细菌生物被膜而造成的危害有十分积极的作用。目前，根据调控系统调控细菌初始黏附的机理及通过抑制细菌初始黏附作用来控制食品品质的方法如表1所示。 细菌初始黏附作用发生在细菌生物被膜形成阶段的初期，是细菌形成生物被膜并造成食品工业污染和浪费，进而危害人类健康的重要因素。细菌初始黏附作用是一个复杂的动态过程，该过程发生在细菌生命周期的整个阶段，且不同细菌的初始黏附作用特点也不尽相同，这就为如何高效且有针对性地抑制细菌初始黏附造成了较大困难。c-di-GMP、双组分调控系统和群体感应系统等细菌调控系统能通过感受外界环境信号，调控包括EPS合成和分泌等多种细菌生命活动，影响细菌初始黏附作用。目前，关于c-di-GMP、双组分调控系统和群体感应系统调控细菌初始黏附作用的研究已经获得不同程度的进展，根据上述研究结果提出有针对性地抑制食源性细菌初始黏附作用的方法也得到了研究人员的关注。但是，不同调控系统调控细菌初始黏附作用的方式不同，且不同环境条件下每个调控系统对细菌初始黏附作用的影响也不一样，因此，深入阐明细菌调控系统对细菌初始黏附作用的调控机制，以及多种调控系统对细菌初始黏附作用的协同调控效果，对于正确研究不同调控系统对细菌初始黏附作用的影响，以及针对性地提出抑制细菌黏附的方法有积极的作用，对进一步研究细菌初始黏附作用的影响因素和特点也有一定的指导意义。 本文《生物被膜初始黏附调控机制及其在食品品质控制中的应用研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷13期203-215页. 作者：熊儒恒,阎俊,谢晶. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220701-002.
