客家“红菌豆渣”主产于福建省武平县，是以豆渣为原料，经过霉制、发酵，分解出游离氨基酸，去除了豆腥味，加工制成的一种产品表面布满橙红色菌丝、风味独特、口感鲜美，富含膳食纤维、蛋白质和氨基酸等营养成分的当地传统美食。本团队前期采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基从“红菌豆渣”中已分离得到其主要的发酵菌株LY03，通过形态学观察、18S rDNA鉴定、重测序及框架图测序，已确定其为Neurospora crassa。 龙岩学院林标声、陈冠羲、黎英*等研究不同发酵时间“红菌豆渣”营养成分分析的基础上，进一步采用现代生物技术寻找影响菌株发酵的主要差异表达基因、关键代谢物和代谢通路，探究cellulase基因的转录表达，对“红菌豆渣”的发酵特性进行深入分析，以获得科学、量化的数据，为提高“红菌豆渣”发酵转化效率及探究其营养成分转化的分子机理提供理论基础，使“红菌豆渣”这一具有地方特色的发酵食品得到更为广泛的发展。
如图1所示，发酵d1，菌丝缓慢生长，豆渣表面开始出现少量菌丝；发酵d2，菌丝开始大量生长，产品表面已布满橙红色菌丝，还出现了少量孢子粉；发酵d3，产生大量孢子粉；发酵d4，菌丝开始老化，颜色变深。 
如表1所示，未接种豆渣中主要成分为碳水化合物（纤维素、淀粉和多糖）和蛋白质，接种菌株发酵后各营养成分发生了明显的变化，其中水分含量先降低后增加，纤维素、总糖含量明显下降，蛋白质、脂肪、灰分、总酸含量明显增加，且发酵后产品各营养成分含量均与发酵前差异显著。总体上发酵d2各项营养指标与发酵前、发酵d1差异显著，而与发酵后d2、d3差异不太显著，表明发酵d2可能是“红菌豆渣”营养物质转化的关键时期。
2 Neurospora crassa LY03菌株在“红菌豆渣”不同发酵时间转录组分析 不同发酵时间“红菌豆渣”菌丝收集获得的各样本总RNA提取质量较好，其OD260/280为2.021～2.157，OD260/230为1.2～2.316，RNA为140～562 ng/µL，样本质量满足建库测序要求。RNA样本反转录成cDNA，将构建好的cDNA文库，通过Illumina HiSeqTM4000测序平台进行转录组测序。测序得到的下机数据去除带有接头（adapter）、N（不确定碱基）含量不小于10%和低质量碱基（Q≤20）含量超过50%的reads，得到分析数据。12 个样本均获得了5.0 G以上容量的原始数据，鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量占比都在54%以上，平均错误率均为0.03%，Q20与Q30分别在97%及91%以上（表2），表明转录组测序所获数据的质量较好，可用于后续分析。两样本之间的相关系数（R2）大于0.80，表明结果可靠且样本选择合理（图2）。 
对基因表达量进行表转化处理后，根据|log2FC|大于1且q值小于0.05的原则筛选DEGs。d2 vs.d1筛选出2814 个DEGs（图3a），有1254 个基因上调表达（包括cellulose基因，ID1007），占总差异表达44.56%；1560 个基因下调表达，占总差异表达55.44%。d3 vs.d2筛选出69 个DEGs（图3b），有57 个基因上调表达，占总差异表达82.61%；12 个基因下调表达（包括cellulose基因），占总差异表达17.39%。d4 vs.d3筛选出1034 个DEGs（图3c），有649 个基因上调表达，占总差异表达62.77%；385 个基因下调表达（包括cellulose基因），占总差异表达37.23%。结果表明d2菌株大量生长、基因表达活跃，与d1差异较大；d3相对于d2差异变化不大；d4与d3差异又增加，表明d4菌株开始老化，基因表达差异明显。以FPKM＞1作为判断基因表达的标准，4 个样本共获得16 个共同表达基因，d2 vs.d1特有表达基因2379 个，d3 vs.d2特有表达基因20 个，d4 vs.d3特有表达基因612 个（图3d），进一步验证了豆渣发酵菌群功能发生明显变化主要在发酵d2。
根据上调差异表达基因KEEG富集分析，分别对富集最显著的20 条KEGG代谢通路分析，富集差异表达基因富集数目最多的信号通路均为“次生代谢物的生物合成”（图4）。其中，d2 vs.d1中，“碳代谢和淀粉和蔗糖代谢”DEGs的富集最显著，表明d2为菌体进行糖类代谢的主要阶段（图4a）。d3 vs.d2中，主要富集到各类的氨基酸代谢，包括“组氨酸代谢”、“色氨酸代谢”、“β-丙氨酸代谢”、“酪氨酸代谢”、“精氨酸和脯氨酸代谢”、“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解”、“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”和“氨基酸生物合成”，表明d3为菌体进行各类氨基酸代谢的主要阶段（图4b）。d4 vs.d3中，DEGs富集显著的代谢途径是“氧化磷酸化”、“淀粉和蔗糖代谢/过氧化物酶体”和“次生代谢物的生物合成”，表明d4菌丝体老化变色可能与其产生的氧化酶类及淀粉代谢生成的深色物质有关，该阶段生成了大量的次生代谢产物（图4c）。3 Neurospora crassa LY03菌株在 “红菌豆渣”不同发酵时间cellulose基因的表达分析 1%琼脂糖凝胶电泳检验表明12 个样本总RNA提取质量较高，12 个样本cellulose基因的real-time PCR的表达水平分析表明，各样本溶解曲线均为单一尖锐峰，表明各扩增产物单一、稳定、复性较好，结果较为准确可靠。cellulose基因与18S基因的real-time PCR扩增效率测定表明，目标基因cellulose和内参基因18S扩增效率一致，实验结果可应用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。结果表明，不同发酵时间样本的cellulose基因在转录水平上的表达2-ΔΔCt值分别为d11.00、d23.46、d32.15、d40.19（图5），cellulose基因的表达呈现出先增加后下降的趋势。其中，d2和d3 cellulose基因的相对表达量均达到过表达水平（≥2），且均与d1相比差异达到显著水平。此外，cellulose基因real-time PCR测定的变化趋势与转录组测序结果一致，表明转录组筛选出的DEGs具有可靠性。5 Neurospora crassa LY03菌株在“红菌豆渣”不同发酵时间转化产物分析 将“红菌豆渣”未接种豆渣及接种后不同发酵时间共15 个产品样本通过UPLC-MS/MS平台进行分析检测到1910 个代谢物。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘（OPLS）分析结果基本一致（图6）。d2、d3和d4样本能更好地聚类在一起，与d0和d1差异较大。“红菌豆渣”不同发酵时间产品代谢物的差异化合物热图分析
将不同发酵时间产品的差异代谢化合物前60 位（变量投影重要性（VIP）大于1，P＜0.05）进行热图聚类分析（图7），结果表明所筛选出的差异化合物主要可分为糖和糖醇、氨基酸、有机酸以及其他代谢物4 大类，其中糖和糖醇类14 个，随着发酵时间的延长，样品中相对含量最高的三乙酸纤维素和纤维二糖逐渐下降，D-阿拉伯糖、山梨醇、D-木糖和L-岩藻糖相对含量逐渐上升再下降，总体上主要糖醇类相对含量变化发生在d2。氨基酸类13 个，随着发酵时间的延长，大部分氨基酸的相对含量明显上升，其中d3为各氨基酸相对含量明显增长的时期，d4氨基酸含量开始降低。有机酸类16 个，总体上发酵前期d1～d3各类有机酸相对含量均较高。在其他代谢物类17 个，随着发酵的进行，豆渣中原有的糖苷类化合物、黄酮类化合物如大豆苷、6-染料木苷、染料木素等分解转化成新橙皮苷、番木鳖碱、尿囊素、十四酸乙酯、溶血磷脂酰胆碱（18:4/18:1）、溶血磷脂酰胆碱（18:1）、次黄嘌呤、角鲨烯、2-羟基腺嘌呤等具有特殊生理活性的物质，总体上d4是各次生代谢物生成的主要时期。5 Neurospora crassa LY03菌株在“红菌豆渣”不同发酵时间转录组与转化产物关联分析
通过KEGG富集分析，把转录组、转化产物分析共同富集到的通路进行整理归纳，挑选出共同富集通路的前10。结果表明，发酵前期d2关键基因和代谢物主要富集在“淀粉和蔗糖代谢”、“碳代谢”和“代谢途径”（图8a），表明该阶段主要进行糖类的代谢；d3主要进行氨基酸和有机酸的代谢，关键基因和代谢物主要富集在“氨基酸生物合成”、“柠檬酸循环”和“丙酮酸代谢”（图8b）；d4关键基因和代谢物主要富集在“次生代谢物的生物合成”和“氨基酸生物合成”，表明该阶段主要进行氨基酸和一些次生代谢物的合成（图8c）。 研究不同发酵时间“红菌豆渣”产品的营养成分，并对其进行转录组测序和转化产物分析，结果表明“红菌豆渣”发酵后其营养成分发生了明显的变化，豆渣原料中的碳水化合物、蛋白等成分转化成了糖类、醇类物质、脂肪酸、有机酸和游离氨基酸等，其中发酵2 d是“红菌豆渣”营养物质转化的关键时期。转录组测序及real-time PCR分析表明，d2基因表达最活跃，主要进行糖类代谢，其中DEG cellulase表达最为活跃；d3主要进行氨基酸代谢；d4主要进行次生代谢产物的生成。转化产物分析表明，d0、d1与d2、d3、d4样品差异较大，而d2、d3和d4样本可以较好地聚类在一起。总体上，d2生成糖醇类和有机酸类化合物，d3生成氨基酸和有机酸，d4生成次生代谢产物及部分氨基酸，另外还生成氧化酶类产生深色物质促使“红菌豆渣”菌丝老化。转录组与转化产物关联分析表明，转录组、转化产物分析共同富集通路主要是“淀粉和蔗糖代谢”、“碳代谢”、“氨基酸生物合成”和“丙酮酸代谢”。 豆渣接种Neurospora crassa进行发酵，能对豆渣原料中的纤维素进行较好地分解，产物为葡萄糖，其中cellulase基因的表达起了重要的作用。real-time PCR测定表明cellulose基因的表达呈现先增加后下降的趋势，其表达量变化趋势与样品中纤维素成分的分解变化及转录组测序结果一致。结 论
“红菌豆渣”接种Neurospora crassa菌株进行发酵，发酵2 d，菌丝生长旺盛，豆渣原料中的碳水化合物、蛋白质等营养物质转化强烈，cellulase基因的表达起了重要的作用；发酵3 d，营养物质转化基本平稳，糖醇、氨基酸、脂类等风味物质生成，产品发酵成熟；发酵4 d，菌丝开始老化，产生了一些具有特殊功能的生理活性物质，但同时产品开始出现腐败。本研究从分子水平上全面分析“红菌豆渣”营养物质转化的机制，可为提高“红菌豆渣”的发酵效率，提升产品品质，促进其产品精深加工和高值化利用提供理论基础。
本文《Neurospora crassa LY03菌株在客家“红菌豆渣”营养物质转化中转录组及转化产物分析》来源于《食品科学》2023年44卷14期197-205页. 作者：林标声，陈冠羲，张清霁，林彬，陈小红，黎英. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220915-143.
