L-甲硫氨酸又称L-蛋氨酸，属于天冬氨酸族氨基酸是生命体必需的唯一含硫氨基酸，在生物体内具备重要生理生化功能。利用微生物发酵生产L-甲硫氨酸具有原料来源广、环境友好且生产成本低的优点。近年来，随着代谢工程研究的深入，通过代谢工程优化通量并最终优化生物过程，在选育氨基酸生产菌株方面应用愈发丰富，代谢工程育种已成为诱变育种的有效替代策略。在氨基酸生产代谢工程改造过程中谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、大肠杆菌（Escherichia coli）等模式微生物已成为主要宿主。

L-甲硫氨酸的生物合成途径包括两个部分：中心代谢途径和天冬氨酸族氨基酸共同途径。具体合成途径如图1所示。

L-甲硫氨酸生物合成途径在C.glutamicum和E.coli中生物合成中间体和调节机制存在异同。在E.coli中，PEPC受到更复杂的激活和抑制作用，包括苹果酸和天冬氨酸的反馈抑制作用。相比而言，C.glutamicum中PEPC在磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的回补反应中发挥作用，但天冬氨酸对该酶并无调控作用。C.glutamicum和E.coli中L-甲硫氨酸合成途径的具体反馈调节信息如图2、3所示。

根据代谢工程改造菌株提高目标氨基酸产量的“进、通、截、堵、出”五字策略，依据目标氨基酸代谢合成途径及网络调控机制，代谢工程L-甲硫氨酸改造策略主要包括以下5 个方面：1）解除代谢途径对关键酶的反馈作用；2）阻断或削弱支路代谢途径；3）中心代谢调控网络的优化；4）增强辅助因子的供应；5）转运系统的优化。

如前所述，C.glutamicum和E.coli中L-甲硫氨酸合成途径存在多分支、多水平的反馈调节，许多关键酶受相应代谢物的反馈抑制或（和）反馈阻遏。在菌株发酵产氨基酸的正向代谢工程中，解除代谢途径关键酶受到的反馈调节可有效促进目标产物L-甲硫氨酸的合成，代谢流的疏通可作为一种策略提高L-甲硫氨酸产量。

在天冬氨酸族氨基酸共同途径中，碳流通过天冬氨酸-β半醛和L-高丝氨酸后流向分支代谢途径，阻断或削弱分支代谢途径可有效调节碳源更多流向目标氨基酸L-甲硫氨酸代谢途径，实现L-甲硫氨酸产量的提升。主要方法包括：L-苏氨酸和L-赖氨酸营养缺陷型的筛选，弱化L-苏氨酸和L-赖氨酸的合成；敲除dapA和thrB基因阻断L-苏氨酸和L-赖氨酸的合成。

一直以来，L-甲硫氨酸中心代谢途径碳分布不平衡是迫切需要解决的问题，其阻碍了代谢物生物合成产量和产率的进一步提高。中心代谢调控网络的优化主要包括碳源利用途径的优化、副产物合成途径的敲除、模块化代谢工程和全局转录机器工程等。

辅助因子的供给和平衡能够避免阻碍代谢途径，对目标氨基酸的合成效率也发挥重要作用，是氨基酸代谢工程的一个重要影响因素。相比于其他氨基酸，合成L-甲硫氨酸需要更多的辅助因子NADPH，是合成L-赖氨酸的2 倍，合成L-谷氨酸的8 倍。NADPH在C.glutamicum和E.coli中以不同的方式提供。增强NADPH的供应最常用的策略是重新分配糖酵解和磷酸戊糖途径之间的代谢流量比。第二种策略是通过糖酵解产生NADPH，通过改变天然NAD依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶编码基因gapA对NADP的辅酶特异性。第三种策略是过量表达来自E.coli的整合烟酰胺核苷酸转氢酶，膜结合转氢酶编码基因PntAB可促进NADP+向NADPH的转化。

用于分子转运的载体蛋白在氨基酸代谢生物合成途径中发挥着重要作用。L-甲硫氨酸在胞内合成后，需要尽快将合成的多余甲硫氨酸运输到胞外，避免在胞内过量积累产生一定毒性使细胞死亡，防止L-甲硫氨酸过量引起的反馈抑制和反馈阻遏，同时有利于L-甲硫氨酸后续提取工艺的进行。对L-甲硫氨酸分泌和吸收运输协同的改造可以促进L-甲硫氨酸的胞内合成，有利于胞外积累。在未来，结合可见光荧光响应官能团与目的转运蛋白融合进一步改进生物传感器的方法，可更好地用于了解细胞内L-甲硫氨酸代谢通量。

吉林农业大学食品科学与工程学院酶分子改造及食品营养分子调控团队通过定向进化酶分子改造强化关键酶的表达，解除或削弱代谢途径相关酶反馈抑制，并通过代谢工程构建高产L-甲硫氨酸工程菌，致力于利用微生物发酵法提高L-甲硫氨酸产量的研究。团队首次发现与C.glutamicum同源相似性达99%的北京棒杆菌（C.pekinense）AK单体别构酶，揭示了单体AK别构调控机制，至今已构建了140余株突变菌株，其中酶活力最大提高99.43 倍，异源表达AK优化后构建C.glutamicum工程菌PEC-lysC^m-hom^m-metX的L-甲硫氨酸最高产量达6.85 g/L，较原菌提高274.32%，具体AK改造后酶活力提升情况如表2所示，为系统阐明关键酶与蛋氨酸生物合成代谢网络相互作用关系，为棒杆菌L-甲硫氨酸合成代谢的调节和氨基酸菌种选育提供了良好借鉴。未来，团队将集中在现有研究成果基础上结合CRISPR技术，深入研究多分支、多水平调控氨基酸合成途径方法，微生物发酵方法的研究以及溶氧、pH值等发酵参数的优化，以求高效改造L-甲硫氨酸生物合成途径，推进玉米淀粉高效生物转化L-甲硫氨酸工业化进程。

在目前的研究报道中，提高L-甲硫氨酸产量具体策略主要包括：优良出发菌种的选择、高产菌株的高通量筛选、合成途径的合理选择以及发酵条件的优化。过表达、弱化表达、定向进化和目标基因的缺失与替换等方法已被广泛应用于优化L-甲硫氨酸生物合成途径。以往对于生物合成L-甲硫氨酸相关的改造研究普遍集中于对天冬氨酸族氨基酸共同途径的代谢调控，但中心代谢途径中碳流量和辅助因子通量变化也会直接影响L-甲硫氨酸的合成能力，后续的研究可主要着重于：1）对中心代谢调控展开更细化的讨论，并在产量最大化的基础上尽量精简调控路线，节约实验成本；2）目前动态调控、精确调控已成为代谢工程研究的主要策略，合理利用动态调控、精细调控代谢过程以平衡菌株生长发育过程与L-甲硫氨酸合成的关系，能够有效调节菌株生产效率并提高L-甲硫氨酸的转化率；3）以合理设计为前提、正向代谢工程为基础的系统代谢工程进行综合应用，深入应用组学数据分析方法，建立计算机高级代谢网络模型，并加强进化、反向代谢工程在高产L-甲硫氨酸代谢工程中的研究利用以提高氨基酸菌株育种效率；4）利用多学科领域交叉联合手段综合运用L-甲硫氨酸代谢设计，利用计算机分析建立基因组精细代谢表达调控模型指导L-甲硫氨酸生产，结合生物传感器、新型功能元件挖掘、CRISPR基因编辑和全基因组池CRISPR干扰等技术进行L-甲硫氨酸代谢途径改造。随着生物信息学与合成生物学的发展与应用，未来利用代谢工程技术生产L-甲硫氨酸将有望实现工业化，L-甲硫氨酸产业将会为人们带来更高的经济效益。