Introduction

凝集素是非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，可与细胞表面碳水化合物特异结合，导致细胞凝集或信号转导。凝集素至少有一个碳水化合物识别域，能与糖蛋白或糖脂的多种类型的碳水化合物部分以非共价方式相互作用。凝集素在多种细胞生理过程中发挥关键作用，包括信号转导、细胞间相互作用和分化等。凝集素广泛存在于病毒、细菌、真菌、植物细胞和动物细胞中。至今，许多凝集素被用作生物技术工具来表征碳水化合物的结构和功能，绘制与各种生理和病理过程相关的细胞表面聚糖变化图谱。凝集素理化特性的多样性（例如分子量、分子结构、亚单位数、碳水化合物特异性）使其具有很大研究和治疗应用潜力。

几个世纪以来，人们已经知道某些食用菌能够治疗各种疾病（包括癌症）的药用特性，并进行了许多临床试验。分类学研究表明，全世界约有140000种蘑菇，其中只有约10%已被鉴定。这些真菌是巨大的潜在可利用生物分子资源库。

迄今为止，从许多食用菌中分离出的凝集素具有显著的抗菌、抗肿瘤和免疫调节活性。其中一些凝集素能与免疫细胞表面分子特异性相互作用，触发具有抗肿瘤活性的细胞因子的分泌。食用菌凝集素由于其新颖的细胞抑制、非细胞毒性和可逆作用机制，是具有广阔前景的抗肿瘤物质。因此，研究食用菌凝集素很有意义。

中国农业大学园艺学院刘庆洪教授、硕士研究生李元慧等在本文分离纯化了黑白栓齿菌凝集素，对黑白栓齿菌凝集素的化学结构进行了表征，分析了其理化性质，并就其对小鼠黑色素瘤的抑瘤率及免疫学机质进行了评价。

Results and discussion

黑白栓齿菌凝集素的纯化

将粗凝集素上CM Sepharose柱，组分C3显示出血凝活性（图1A）。C3上苯基FF柱，50 mmol/L HAc-NaAc缓冲液（pH 5.4）洗脱的C3P2具有血凝活性（图1B）。C3P2过Superdex 75凝胶过滤柱，仅检测到C3P2S3具有血凝活性（图1C）。随着纯化的进行，凝集活性组分最终在SDS-PAGE上显示为一条单带，分子量为14.4 KDa（图1D），血凝活性回收率约为60%，纯化倍数为20，黑白栓齿菌凝集素（PML）对兔红细胞血凝比活力为13319 U/mg（表1）。

图1 凝集素纯化过程表1 黑白栓齿菌纯化效率

凝集素性质表征

PML经Superdex 200 凝胶过滤柱层析后，保留体积为15.54 mL，通过蛋白标准曲线计算求得，PML 分子量为28.8 kDa。SDS-PAGE结果显示，PML在还原条件下分子量为14.4 kDa，说明PML由两个相同分子量的亚基组成。PML在pH 6-9，温度20-60℃时活性保持稳定。Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺可不同程度促进PML的血凝活性。

图2 PML分子量测定

表2 不同pH下PML的血凝活性变化

表3 不同温度下PML的血凝活性变化

表4 不同离子对PML的血凝活性影响

PML在小鼠模型中的抗肿瘤活性

不同的PML给药剂量0.5、1.0、2.0 mg/kg，肿瘤抑制率分别为36.1%、47.8%和35.7%。PML对黑色素瘤抑制为出非剂量依赖效应，1.0 mg/kg PML产生了最佳的肿瘤抑制效果，但其抑制率小于CTX（73.3%）。随着时间的延长，各处理组中小鼠体重均逐渐增长，PML处理对荷瘤小鼠的体重无显著影响。

图3 PML对小鼠皮下黑色素瘤抑制效果

进一步研究了PML对小鼠免疫器官指数的影响。与空白组相比，模型组胸腺指数显著降低，而PML组胸腺指数显著升高，CTX组的胸腺指数低于模型组。与空白组相比，模型组脾脏指数显著升高，但PML组和模型组的脾脏指数没有显著差异。CTX组脾脏指数同样显著下降。上述结果表明，PML处理能够逆转肿瘤引起的胸腺指数下降，但对脾脏指数影响不显著。

图4 PML对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响

ACF、ACP和ACFP减轻HF饮食诱导的肝功能生物标志物和组织病理学异常变化

细胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α均参与控制肿瘤生长。IL-2介导免疫细胞激活并显示抗黑色素瘤的抗肿瘤活性。IL-10是一种细胞因子合成抑制因子；它抑制IL-2、IFN-γ和TNF-α的产生。干扰素-γ具有细胞毒性，有助于启动肿瘤细胞凋亡，并增强其他免疫抑制机制。TNF-α是一种可溶性细胞毒性因子，通过抑制CD8+T细胞活性、触发黑色素瘤脱分化、促进免疫逃逸和黑色素瘤复发，作为免疫反应的关键负性调节剂。这些细胞因子在控制黑色素瘤生长方面表现出相互作用和协同作用。I、II和III组的IL-2含量低于模型组。I、II和III组的IL-10含量高于模型组。所有实验组的IFN-γ含量均较低。I、II和III组的TNF-α含量低于模型组。IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α的产生在模型组和CTX组之间没有显著差异。

图5 PML对荷瘤小鼠血清中细胞因子含量的影响

Conclusion

通过一系列优化的色谱步骤从黑白栓齿菌子实体中纯化了一种新的28.8 kDa凝集素，命名为为PML。PML血凝活性不受各种测试糖的抑制，在各种温度和pH条件下稳定。在B16黑色素瘤小鼠模型中，PML显示出抗肿瘤活性，并增强了细胞因子IL-10的含量。因此，PML是一种很有前途的新型抗癌治疗剂。

第一作者简介

李元慧，男，中国农业大学园艺学院2019级硕士研究生。

通信作者简介

刘庆洪，男，理学博士，中国农业大学园艺学院教授，博士生导师。主要研究药用及食用真菌功能性多糖、蛋白质、活性小分子及其衍生物的化学结构、功能性评价、制备工程新技术、新产品等。主持国家、省部级及地方项目多项，获省部级奖励成果2项，发表文章30多篇。

A novel lectin from mushroom Phellodon melaleucus displays hemagglutination activity, and antitumor activity in a B16 melanoma mouse model

Yuanhui Li^a, Peng Wang^a, Zejun Zhang^b, Qinghong Liu^a,*

^a Department of Vegetables, College of Horticulture, China Agricultural University, Beijing 100193, China

^b College of Food Science & Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100193, China

*Corresponding author.

Abstract

A novel lectin (termed PML) was purified from fruiting bodies of the edible mushroom Phellodon melaleucus (division Basidiomycota) by ion exchange, hydrophobic interaction, and gel filtration chromatographies, with overall titer recovery ~60 % and 20-fold purification. PML displayed hemagglutination activity 13319 units/mg toward rabbit erythrocytes. SDS-PAGE and gel filtration analyses revealed that PML is a homodimeric lectin with a molecular weight of 28.8 kDa. PML hemagglutination activity was not inhibited by various simple sugars or their derivatives, but was enhanced by cations Ca2+, Mg2+, Zn2+, and Cu2+. The activity was stable in pH range 6–9 and in the temperature range 20–60 °C. Circular dichroism (CD) spectroscopic analysis showed that PML was composed primarily of β-sheets with low α-helix content. In a B16 melanoma mouse model, PML treatment significantly inhibited tumor growth, and increased cytokine IL-10 content. Our findings suggest that PML is a potential anticancer therapeutic agent.

Reference:

LI Y H, WANG P, ZHANG Z J, et al. A novel lectin from mushroom Phellodon melaleucus displays hemagglutination activity, and antitumor activity in a B16 melanoma mouse model[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1885-1892. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.040.