云南民族大学民族医药学院杜刚教授等：开菲尔粒中白地霉的分离鉴定及挥发性成分分析
2023-08-16作者：来源：责任编辑：食品界
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开菲尔，又称雪莲菌，是一种产自产高加索山脉和我国西藏地区的混菌发酵酸奶。开菲尔对多种炎症、血清胆固醇、高血压有改善的功效。近年来，利用宏基因组技术研究开菲尔体系的菌群结构，发现开菲尔体系中包含乳杆菌属、双歧杆菌属、酿酒酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、白地霉（Geotrichum candidum）等真菌和细菌。同时对分离自开菲尔体系的菌株已进行了基因组研究 。
云南民族大学民族医药学院李智昊、莫海英、杜刚*等对分离自开菲尔体粒的G. candidum菌株进行基因组重测序，从基因组层面进行分类鉴定研究；对实验菌进行功能注释，了解开菲尔源G. candidum的基因组结构和功能，挖掘其挥发性香味物质的代谢途径；利用气相色谱-质谱（GC-MS）联用法对挥发性物质进行鉴定。本研究可为开菲尔源G. candidum在食品中的应用提供理论基础。 
1. K2菌株电镜下形态观察
如图1所示，K2菌株形态为圆柱形，外壁有外壳包裹，菌株单个大小约为（5.8±1.0）μm×（2.3±0.4）μm，菌体表面粗糙且有不规则褶皱，无破损现象，相邻菌株间无黏连现象。Z7-1、Z8-4两株菌菌株形态为圆柱形，外壁有外壳包裹，单个大小在（12.5±3.5）μm×（3.0±0.5）μm，菌体略大于K2，菌体表面有不规则褶皱。3 株菌均与已报导G. candidum结构相似。 如表1所示，实验菌株K2在葡萄糖和蔗糖试管内为阳性、Z7-1、Z8-4在葡萄糖、麦芽糖和蔗糖管中为阳性，结果表明K2、Z7-1、Z8-4菌株均可以利用并分解葡萄糖和蔗糖产生相应的酸，同时Z8-4、Z7-1还可以利用及分解麦芽糖。IMViC实验结果显示，实验菌株K2、Z7-1、Z8-4在伏普实验及中为阴性；在吲哚实验及甲基红实验中呈阳性。表明3 株菌可以利用色氨酸，且可代谢葡萄糖产酸。 从基因组中找到26S rDNA，利用软件MEGA7.0构建进化树。3 株菌的26S rDNA在NCBI用BLAST查找近缘物种，基于序列相似度，选取G. candidum KR632575.1、里氏半乳酵母（Galactomyces reessii NG055388）、森林地霉（Geotrichum silvicola KC510046）、白花双足囊菌（Dipodascus albidus NG066154）、膝状双足囊菌（Dipodascus geniculatus NG066466）、克氏地霉（Geotrichum klebahnii MH130231）、彩囊钙丝菌（Badhamia utricularis HQ604855）、冠突曲霉（Aspergillus cristatus MG199954.1）构建进化树。如图2所示，进化树中3 株实验菌株均与G. candidum聚在一簇，鉴定3 株实验菌株K2、Z7-1、Z8-4均为真核生物界（Eukaryota）双核亚界（Dikarya）子囊菌门（Ascomycota）酵母亚门（Saccharomycotina）酵母纲（Saccharomycetes）酵母目（Saccharomycetales）双足囊菌科（Dipodascaceae）地霉属（Geotrichum）G. candidum。 
DNA片段采用软件plantnus进行组装得到基因组信息，如表2所示，K2、Z7-1、Z8-4长度分别为24 984 695、25 295 181、24 887 411 bp，GC含量分别为41.43%、41.37%、41.39%。结合组装结果及统计信息（表3），3 株菌与已报道多株G. candidum的基因组大小、GC含量相近。
K2、Z7-1、Z8-4的基因组序列与G. candidum LMA-244、G. reessii LMA-1148、D. albidus NRRL Y-12859、D. geniculatus NRRL Y-17628四种参考菌株的基因组序列进行BLAST、DDH和ANI比对鉴定，如表4所示，K2、Z7-1、Z8-4与已知G. candidum LMA-244的本地BLAST（2.6.0）结果分别为99.00%、99.00%、99.00%，DDH结果为99.50%、99.40%、99.50%，其结果均大于70%，可以支持归为同一物种，ANI的结果为98.66%、98.65%、98.68%，均大于95%～96%，同样支持归为同一物种。依据BLAST、DDH和ANI的比对分析结果与26S rDNA在NCBI上BLAST比对结果一致。进一步确证菌株K2、Z7-1、Z8-4为G. candidum LMA-244。
选取G. candidum K2进行蛋白质编码基因预测，在GO数据库中注释到46 127 个基因。如图3所示，细胞组成约占总功能注释的40.74%，其中的细胞部分和途径基因富集程度最高，均有4 172 个基因；生物过程约占总功能注释的47.54%，其中的细胞过程途径基因富集程度最高，有3 869 个基因，表明G. candidum K2含有大量与生物学过程相关的基因，包括参与自身的核苷酸代谢、嘌呤代谢、细胞分裂等过程；分子功能约占总功能注释基因的11.73%，其中的催化活性（途径基因富集程度最高，有2 075 个基因。
图4显示，G. candidum K2基因组中与其对应的基因共7 311 个，按功能可分为细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢、生物系统6 大类。其中富集最高的为信号转导有369 个基因；富集程度较高的分类有翻译、运输和分解代谢、碳水化合物代谢分别注释到367、338 个和326 个基因。这些途径对于维持菌体正常生命活动必不可少，故有大量基因富集。8 COG分析结果
在COG分析（图5）中，共注释到G. candidum K2基因组的蛋白质编码基因共4 568 个，将其按功能分为23 个不同类型。主要包括：翻译后修饰、蛋白质折叠和伴侣蛋白424 个，胞内转运、分泌和小泡运输421 个，翻译、核糖体结构和生物合成386 个，转录380 个及信号转导机制374 个。 萜类合成途径与挥发性香味物质的产生密切相关，KEGG富集分析挖掘到萜类骨架合成、倍半萜类及三萜类生物合成相关基因见表5。如图6所示，在萜类骨架的合成途径中共有31 个蛋白编码了戊二醛二磷酸合酶，该酶将起始物焦磷酸香叶基香叶酯生成戊二酸焦磷酸，再经过由2 个蛋白编码的贝壳杉烯氧化酶生成贝壳杉烯酸酯。贝壳杉烯酸酯作为一种二萜化合物经常用于合成其他萜类化合物。如图7所示，三萜化合物的合成途径中由3 个蛋白编码的角鲨烯单加氧酶将底物鲨烯催化合成三萜化合物2,3-环氧鲨烯。2,3-环氧鲨烯可以经过次生代谢途径参与合成其他固醇类化合物。萜类合成途径分析表明G. candidum K2具备合成挥发性香味物质的遗传基础。 
10 GC-MS分析结果
图8为G. candidum K2在YPD液体中挥发性成分GC-MS总离子流色谱图，其分析结果见表6。共鉴定得到50 种挥发性物质，其中包括烃类、醇类、酯类、酮类、萜类物质。其中烃类共9 种占比18.0%，醇类共3 种占比6.0%，酯类共6 种占比12.0%，酮类共5 种占比10.0%，萜类共27 种占比54.0%。 本研究中分析到多种萜类挥发性成分，3-蒈烯、α-蒎烯、对伞花烃呈花香，L-α-松油醇、4-萜烯醇、萜品醇呈松木和丁香的香气，且阈值较低。酯类化合物多数都有香味，主要表现为花香味，其中乙酸α-松油酯呈木香花香味。 从昆明地区的开菲尔粒中分离得到3 株实验菌株K2、Z7-1、Z8-4，结合形态观察、26S rDNA序列同源性分析初步鉴定为G. candidum。对3 株开菲尔源的G. candidum基因组测序，分析K2、Z7-1、Z8-4与奶酪来源G. candidum LMA-244的基因组相似度，DDH分析相似度分别为99.50%、99.40%、99.50%， ANI分析相似度分别为98.66%、98.65%、98.68%。最终鉴定K2、Z7-1、Z8-4均为G. candidum LMA-244。 采用菌株的26S rDNA而非ITS序列鉴定，是基于研究发现26S rDNA相对ITS序列包含更丰富的信息，同时26S rDNA的D1/D2区序列已建成了完备的分析数据库，对酵母属菌种的鉴定更为准确。鉴定结果K2、Z7-1、Z8-4与已知的异源G. candidum LMA-244归为同一物种。 萜类合成途径与挥发性香味物质的产生密切相关， KEGG富集分析挖掘到萜类骨架合成、倍半萜类及三萜类生物合成相关基因，表明G. candidum K2具备合成挥发性香味物质的遗传基础。G. candidum K2在发酵过程中产生复合花果香气， GC-MS分析发现50 种挥发性化合物，3-蒈烯、α-蒎烯和对伞花烃呈花香，L-α-松油醇呈松木香，4-萜烯醇、萜品醇呈丁香味，乙酸α-松油酯呈木香花香。推测G. candidum是开菲尔体系香味物质的重要贡献菌株。 本研究通过基因组测序和生物信息学分析，研究开菲尔源的G. candidum的基因组结构和功能。GO注释结果显示，催化活性和结合等分子功能方面是G. candidum K2的蛋白功能主要集中区，该类蛋白广泛参与细胞代谢过程以及自身生化反应所需的催化过程，为蛋白质的合成加工及其功能发挥提供了分子基础。KEGG结果表明，G. candidum K2的代谢途径丰富，能够满足生物体自身与外界环境进行能量和物质交换，同时能对外界环境变化作出及时的反应，增强了供试菌对环境的适应性。COG预测显示有丰富的基因参与生命体的次生代谢产物的合成、运输及代谢，表明其次生代谢途径众多，值得后期进行进一步挖掘有价值的次生代谢产物。本研究对G. candidum K2进行了基因组测序与分析，便于全面地认识该菌株，为开菲尔源的G. candidum的应用提供理论基础。 本文《开菲尔粒中白地霉的分离鉴定及挥发性成分分析》来源于《食品科学》2023年44卷10期123-131页.作者：李智昊，莫海英，陈 鑫，银蒙芳，杜刚. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220514-181.
