淮阴工学院时号副教授等：高温木聚糖酶Pthxyn酶学性质及其在啤酒酿造中的应用
2023-08-16作者：来源：责任编辑：食品界
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木聚糖是半纤维素的主要成分且分布广泛，其主链主要由木糖聚合而成、侧链含有多种取代基且结构复杂的异质多糖。降解木聚糖的水解酶中最为重要的糖苷水解酶（GH）是β-1,4-内切木聚糖酶。木聚糖酶主要分布于GH10和GH11家族，其在食品、饲料、造纸、纺织与生物能源领域被广泛应用。
大麦芽发酵啤酒历史悠久。大麦芽胚乳细胞壁含有26% β-葡聚糖与约71%的阿拉伯木聚糖。在麦芽糖化阶段添加木聚糖酶，可以降低阿拉伯木聚糖黏度和提高麦汁过滤率。尽管目前已有很多关于木聚糖的报道，但在麦芽汁糖化过程中应用效果较好的木聚糖酶仍然很少，因此需要通过基因工程的方法，提高木聚糖酶在麦芽糖化过程中的催化活性。 
淮阴工学院生命科学与食品工程学院李青飞、刘 越、时号*等将来源于极端嗜热细菌Pseudothermotogathermarum的高温木聚糖酶基因在大肠杆菌中进行克隆、表达、纯化及重组蛋白的酶学性质研究，将其应用到啤酒糖化过程中并分析水解产物中木糖和葡萄糖含量变化。研究可为重组木聚糖酶在啤酒酿造工业中的潜在应用提供一定理论支持。
将IPTG诱导后的重组菌株发酵液离心、洗涤、重悬，超声波破碎，高速离心获得粗酶液，按上述DNS法测定重组酶活力，结果测得木聚糖酶粗酶液比活力为25.74 U/mg，亲和层析纯化后，该重组酶的比活力达到151.9 U/mg。SDS-PAGE 结果显示，约在130 kDa存在的蛋白条带分子质量与该酶理论分子质量一致（图2）。此结果表明重组木聚糖酶蛋白已成功表达和纯化。 
2 重组木聚糖酶学性质
2.1 木聚糖酶Pthxyn最适反应温度及稳定性
在pH 5.5条件下，检测重组木聚糖酶在60～100 ℃范围内活力（图3a）可知，处于90～100 ℃范围内的重组木聚糖有较高的催化活性，该酶最适反应温度为95 ℃；由图3b可以看出，该重组酶具有较好的热稳定性，75 ℃处理重组木聚糖酶1 h，剩余酶活力约为83%，随后活力不断下降，到达2 h时，酶活力仍有57.7%，80 ℃处理1 h，剩余酶活力约为53.3%，随后酶活力不断下降，到达2 h时，酶活力仅有26.8%，然而在85 ℃处理1 h，剩余酶活力约为43%，到达2 h后，酶活力几乎丧失。
2.2 木聚糖酶Pthxyn最适反应pH值及稳定性 在80 ℃条件下，检测重组木聚糖酶在pH 4.0～9.0范围内活力（图3c），结果表明，酶最适pH值为5.5；由图3d可以看出，重组木聚糖酶在pH 5.0～8.0的条件下保温2 h，仍具有80%的酶活力，表明该酶具有较好的pH值稳定性。当该重组木聚糖酶在pH 5.0～8.0范围之外时，该酶的稳定性变差。 图4结果表明，当终浓度为1 mmol/L和10 mmol/L时，K＋、Ni2＋、Ca2＋、Co2＋、Mg2＋、Tris、Tween 80均对酶活力有激活促进作用。但是，Cu2＋、SDS均明显抑制重组酶活力。其中，当Ba2＋浓度为1 mmol/L时，重组酶活力被提高至1.25 倍，而Ba2＋的浓度为10 mmol/L时，几乎丧失酶活力。1 mmol/L Mn2＋对重组酶活力起轻微抑制作用，而10 mmol/L Mn2＋能将酶活力提高至2.9 倍。因此适当添加上述促进因子，能够显著提高重组酶水解效率，而EDTA对其酶活力几乎没有影响。
表1显示，重组木聚糖酶能够水解木聚糖，但不能水解CMC-Na、葡聚糖等，表明该酶是通过内切方式降解木聚糖。 木糖质量分数为0.2 %～0.5 %，磷酸盐缓冲液pH 5.5，在80 ℃处理10 min。由图5测得重组酶对木糖的Km和Vmax分别为0.36 mg/mL和243 U/mg。结果表明重组木聚糖酶具有较好的催化效率。 
如图6所示，以大麦初始样品为例，木糖与葡萄糖出峰时间分别约为5 min和7 min，并且木糖和葡萄糖出峰面积均较小；加入重组木聚糖酶后的大麦样品在相近的出峰时间处，木糖与葡萄糖出峰面积较初始大麦样品中峰面积呈正相关趋势，这是因为加入的重组木聚糖酶与内源性的葡聚糖酶产生协同效应，使得大麦中木聚糖与阿拉伯糖水解成木糖，而大麦中内源性的葡聚糖酶，由于两种酶的协同效应也使得葡聚糖进一步水解为葡萄糖。再通过大麦、小麦标准曲线与两者峰面积可以计算出大麦、小麦中初始的葡萄糖与木糖含量，以及添加木聚糖酶后酶解液中葡萄糖和木糖生成量。
反应体系50 mL，图7a显示，空白组中大麦汁中约含有葡萄糖20 g/L，木糖仅有0.017 g/L，随着木聚糖酶的添加，与大麦中内源性酶产生协同效应，使得葡萄糖与木糖产率提高。当木聚糖酶添加量为4 mg时，葡萄糖与木糖生成量约为36.52 g/L和1.24 g/L，继续添加木聚糖酶，结果表明葡萄糖与木糖的最大生成量分别约为36.57 g/L和1.25 g/L，当酶添加量达到4 mg后，葡萄糖和木糖几乎不再增多。 由图7b所示，空白组中显示小麦含有21.9 g/L的葡萄糖，木糖仅有0.003 g/L，添加一定量木聚糖酶后，葡萄糖和木糖的含量明显增多。当木聚糖酶添加量为4 mg时，葡萄糖和木糖生成量分别为36.57 g/L和0.706 g/L，当木聚糖酶添加量超过4 mg时，葡萄糖和木糖含量几乎维持不变，最终得到葡萄糖最大生成量为36.63 g/L，木糖为0.708 g/L。 
目前，已有多种耐高温或耐酸性木聚糖酶在大肠杆菌中成功实现异源表达。而本研究从嗜热厌氧菌P. thermarum中分离出来的木聚糖酶基因pthxyn表达水平明显高于很多木聚糖酶在大肠杆菌中的表达。因此木聚糖酶基因pthxyn的高效表达在生产中具有重要应用价值。 对于P. thermarum产生酶研究集中在作为辅助因子提高赖氨酸合成量方面。而P. thermarum产生木聚糖酶的研究尚鲜有报道，本研究从该菌中分离出耐酸耐高温的木聚糖酶基因，成功在大肠杆菌中诱导表达、纯化，并得到了可溶性的木聚糖酶，该重组木聚糖酶pH值耐受范围为5.0～8.0，保温2 h仍能保持80%酶活力；在75 ℃保温1 h，仍能保持80%酶活力。大多数金属离子和EDTA对该重组木聚糖酶影响较小。该重组木聚糖酶酶学性质明显优于很多木聚糖酶。此外，本研究木聚糖酶基因pthxyn还能够显著降解麦芽糖化过程中的阿拉伯木聚糖，从而降低麦汁黏度，提高过滤速度，改善啤酒品质。 耐酸耐高温木聚糖酶在实际应用中非常重要，但通过基因工程改造获得的耐酸耐高温木聚糖酶只能温度或pH值耐受性符合生产要求，难以两者兼顾。在啤酒酿造的麦芽汁糖化阶段，pH值大致为5.0～6.6，温度为65～71 ℃，而本研究获得的木聚糖酶pH值耐受范围为5.0～8.0，75 ℃保温1 h，仍能保持83%酶活力，其性能相比较其他几种应用于啤酒酿造中的木聚糖酶均具有明显优势。 本研究从P. thermarum分离出耐酸耐高温的木聚糖酶基因，并通过大肠杆菌实现了高效表达，获得的重组木聚糖酶比活力达到151.9 U/mg。由于该重组酶具备较好的耐热耐高温特性，因此首次尝试将该重组酶直接应用到麦芽汁糖化过程中，结果表明，大麦和小麦中木糖分别增加了1.233 g/L和0.705 g/L，麦芽汁黏度显著降低。综上所述，该重组木聚糖由于其良好的耐酸耐高温特性，及其能降低麦芽汁黏度，提高过滤速度，因此在酿造工业中具有很好的应用前景。
本文《高温木聚糖酶Pthxyn酶学性质及其在啤酒酿造中的应用》来源于《食品科学》2023年44卷第10期181-187页，作者：李青飞，刘越，言行，聂新玲，李相前，谭中标，时号。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220503-024。
