食品界

J. Future Foods | 王彦波教授：基于两性离子抗冻水凝胶和茜素的比色指示剂用于鲑鱼片

01 Abstract

指示水凝胶由于其明显的颜色变化，在水产品的新鲜度显示方面具有快速、灵敏、实时的优点。本研究开发了一种pH敏感茜素抗冻水凝胶，并将其作为监测水产品低温腐败的原始比色指标。以2-羧基丙烯酸乙酯、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]-三甲基氯化铵和2-甲基丙烯酸羟乙酯单体为原料，以三甘醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备了抗冻水凝胶。水凝胶具有良好的抗冻性能，并进一步加入pH敏感染料茜素以获得指示性能。将该指标应用于低温贮藏条件下鲑鱼新鲜度的指示，发现其颜色变化与鲑鱼挥发性总碱态氮含量相对应，相关系数为0.9596。这些结果证明了其应用前景。

02 Introduction

水产品是日常饮食中优质蛋白质的重要来源之一。但是，由于在运输或储存过程中微生物的污染，它很容易变质。腐烂的水产品会给消费者的健康带来严重的风险，并造成巨大的经济损失。随着人们对新鲜、安全的水产品需求的不断增长，新鲜度检测方法应运而生。目前，水产品新鲜度的检测方法有感官检测、微生物检测和理化检测(如总挥发性碱性氮(TVB-N))。但这些方法存在预处理复杂、耗时长、需要专业人员和/或设备等缺点。因此，发展快速、简单、实时的新鲜度监测指标成为近年来的研究热点。

水凝胶具有快速、廉价、操作简单等优点，已被证明是一种实用的鱼类新鲜度监测方法。同时，其良好的吸湿性提高了刺激响应材料对腐败过程中产生的目标化学品的颜色响应，在智能包装中具有很大的应用潜力。有研究团队开发了一种基于藻酸盐-甲基纤维素混合水凝胶的简单比色氨传感器，用于监测猪肉的腐败情况。水凝胶指示剂可以清楚地指示肉末的颜色变化，TVB-N含量和pH值的变化与颜色变化呈正相关，证明了其在指示新鲜度方面的应用潜力。有研究报道了一种以甘蔗渣纳米纤维素为基础的水凝胶指示剂，该指示剂可以通过颜色的变化成功地区分腐坏物，证明了其在指示新鲜程度方面的应用潜力。还有研究报道了一种蔗渣纳米纤维素基水凝胶指示剂，该指示剂能够成功鉴别鸡肉的腐败。水凝胶内的pH指示剂与溶解的CO₂反应后，可以显示出明显的颜色变化，从而反映鸡肉的新鲜度。虽然比色水凝胶有希望用于监测食品的新鲜度，但其仍然面临一个问题:在零度以下的条件下，冷冻是不可避免的。然而，为减少潜在的腐败，水产品往往通过冷链运输或储存在低温环境(-20 °C)。在这样的低温环境下，水凝胶型新鲜度指示器的机械强度可能会由于水凝胶内部结冰的现象而降低，从而影响水凝胶的基本功能。同时，冷冻水凝胶的敏感性会受到冰晶融化后产生的水分的影响，这是智能包装的弊端。因此，迫切需要开发适用于低温的水凝胶型指示剂。

近年来，已经开发了一系列策略来增强水凝胶对低温环境的耐受性。其中之一是将盐加入水凝胶中。通过添加这些分子，可以抑制水分子的聚集，并且内部氢键将被削弱，从而导致水凝胶的低凝固点。因此，它可以有效地防止在零度以下的温度下在水凝胶内部形成冰晶。然而，高浓度的盐可能会削弱水凝胶的机械性能，并且盐的泄漏可能会降低水凝胶的抗冻能力。越来越多的研究发现，嵌入有两性离子渗透剂（如甜菜碱或脯氨酸）的水凝胶具有良好的抗冻性能。这是因为两性离子渗透剂可以干扰水分子形成致密的氢键结构，从而抑制水的冻结过程。受上述研究的启发，作者希望开发一种在水凝胶骨架中引入两性离子的耐寒水凝胶指示剂。

此研究探索了一种快速、简单和有效的检测系统，从两性离子水凝胶(Z-H)和茜素视觉检测水产品的新鲜度(图1)。Z-H由2-羧基乙基丙烯酸酯(CAA)，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TM)，和2-羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)单体使用三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)作为交联剂，验证了Z-H的抗冻性，然后在Z-H中加入茜素染料，实现对低温保存的鱼肉的新鲜度监测。并与基于TVB-N的传统方法进行比较，分析了指示性水凝胶在评价鲑鱼新鲜度方面的性能，验证了其在低温贮藏和冷链运输中的实际应用潜力。

图1 鱼类新鲜度监测用水凝胶指示示意图

03 Results and Discussion

两性离子抗冻水凝胶的制备

近年来，人们发现在水凝胶中嵌入甜菜碱等两性离子可以显著提高水凝胶的抗冻性。因此，作者将两性官能团引入到水凝胶骨架中，开发了Z-H。两性离子基团可以通过静电作用与水分子相互作用，干扰水分子形成致密的氢键结构，从而抑制水的冻结过程。TM和CAA被认为是制备两性离子材料的典型单体。因此，以CAA为阳离子单体，TM为阴离子单体，TEGDMA为交联剂，采用化学交联方法制备Z-H。为了使水凝胶具有更好的力学性能，由于HEMA可以提供额外的氢键位点来加强Z-H网络，因此研究中以共聚体的形式添加了HEMA。水凝胶的红外光谱如图S1所示。1 727 cm^-1处的峰值是-COOH基团的C=O伸缩振动。3 432 cm^-1处的峰为季铵盐的N-H。这表明水凝胶是两性离子，基团既带正电又带负电。

水凝胶聚合物在水中的溶胀性能尤为重要，因为许多应用都依赖于这一关键性能。已研究了水凝胶在超纯水中的室温溶胀性能，包括时间对水凝胶溶胀率的影响。计算不同时间水凝胶的溶胀比，结果如图S2所示。水凝胶样品的溶胀比在浸泡前60 min显著增加，并在浸泡1 500 min前保持稳定。P-H的溶胀比高于Z-H。这种现象可能是由于Z-H具有较强的交联网络结构和更多的氢键纠缠，使凝胶网络更加致密，防止水分子进入水凝胶网络的空腔。因此，P-H比Z-H具有更好的吸水性。

图1 茜素粉、两性离子水凝胶（Z-H）和茜素-两性离子水凝胶（AZ-H）的傅里叶变换红外光谱

图S2 PVA水凝胶（P-H）和两性离子水凝胶（Z-H）在不同时间的溶胀指数

Z-H的抗冻性

机械性能，如断裂伸长率和拉伸强度，是水凝胶在应用过程中完整性和拉伸能力的关键因素。因此，对水凝胶的这些力学性能进行了仔细的表征。Z-H在-20 ℃时的抗拉强度为3.19 MPa，略高于室温时的抗拉强度。此外，Z-H在-20 °C下可以拉伸到24.5%的应变，略低于室温下的应变(图2A)。这些结果表明，Z-H在低温下仍然保持着良好的力学性能和稳定性。同时，从图2B中可以看出，Z-H在-20°C放置一段时间后，仍然具有良好的柔韧性，而P-H水凝胶在弯曲过程中容易断裂。这是由于P-H在低温下的结冰作用造成的。为了进一步探索水凝胶的低温适应性，通过DSC测试对P-H和Z-H的抗冻能力进行了表征。在DSC热像图上，P-H在-16 ℃附近有一个尖峰，说明发生了结冰现象。而Z-H在整个冷却过程中均未发现冻结现象(图2C)。如图2D所示，水凝胶样品在-20 °C保存35 min, P-H形成白霜，由于形成冰晶，透明度降低。结果表明，Z-H在低温下具有良好的抗冻性。

图2 水凝胶的力学性能。(A)不同温度下Z-H的拉伸强度和断裂伸长率(n = 3);(B) Z-H和P-H在-20 °C的弯曲能力照片;(C) Z-H和P-H的DSC热图;(D) Z-H(左)和P-H(右)在-20 °C的照片

AZ-H的pH敏感性

为了使水凝胶具有pH响应性，作者以茜素作为pH敏感染料的代表，因为研究人员发现茜素对pH响应快，颜色变化明显。颜色的变化是由于茜素在不同pH值下的可逆结构转变，羟基允许质子通过分子内氢键转移。作者还从实验中观察到茜素溶液在不同pH值下的视觉色差(图3A)。在酸性pH (ph3,5)条件下，茜素溶液呈黄色(中性)。随着pH值的增加，茜素在pH值为7(单阴离子)时颜色由黄色变为红色。当pH值为9时，茜素颜色呈紫色，当pH值为11时，茜素颜色加深。不同pH条件下茜素溶液的UV-Vis光谱如图3B所示，这也证明了茜素的pH敏感性。

唾液中与淀粉消化相关的主要酶是唾液α-淀粉酶，它通过切断α-1,4糖苷键将淀粉分解为麦芽糖、麦芽糖和α-限制糊精。研究表明，口腔中的淀粉酶在几秒内大幅降低了淀粉粘度。众所周知，黏度是决定淀粉团胃排空率的关键因素。唾液α-淀粉酶也能在胃强酸性条件下存活，在小肠中仍有一定活性。

将茜素加入到Z-H中制备指示剂水凝胶，红外光谱证实指示剂水凝胶制备成功。与Z-H相比，茜素两性离子水凝胶(AZ-H)的红外光谱在波数为1 450和1 584 cm^-1时，也呈现出茜素中芳香环的−C=C−键(图S1)。结果表明，水凝胶的制备是成功的。

为了研究鱼类腐烂过程中AZ-H对挥发性氮化合物的敏感性，作者选择NH3作为代表化合物，研究人员指出，NH3可以模拟鱼类腐烂过程中挥发性氮化合物的产生。由于肉眼观察的结果会产生误差，因此从AZ-H图像中采集R、G、B值的信号变化。以RGB值的三个分量的总变化率来表征指标的灵敏度。本文研究了指示剂水凝胶在不同时间对不同浓度NH3的敏感性，以评估水凝胶(SRGB)对挥发性氮化合物的敏感性。如图3C所示，AZ-H在5 min后变色，水凝胶的SRGB分别增加到20.9% (0.08 mol/L)和58.1% (0.8 mol/L)， 30 min后SRGB分别增加到52.1% (0.08 mol/L)和75.4% (0.8 mol/L)。水凝胶的变色与碱性环境中茜素酚类氧阴离子的形成有关。同样，有研究报道了加入茜素的纤维素纳米纤维/聚乙烯醇薄膜在含氨试剂瓶中悬挂时呈紫色。还有研究发下发现茜素pH敏感指示剂水凝胶对0.8 mol/L的氨水溶液24 min的灵敏度(SRGB)为72.4%，对氨水表现出较高的灵敏度和显色响应。指示性水凝胶的快速和高响应性通常是智能食品包装应用的预期特征。在这个意义上，指示水凝胶被认为适合用作气体传感器。

图3 茜素和茜素基水凝胶的ph敏感性。(A)茜素溶液在不同pH值下的照片和(B)可见光谱防冻指示剂水凝胶对0.08 (C1)和0.8 mol/L (C2)氨水30 min (n = 3)的显色响应

指示水凝胶在鲑鱼新鲜度监测中的应用

为了验证这一概念，作者以鲑鱼为模型食品，进一步验证了AZ-H在鱼类新鲜度评价中的潜在应用。水凝胶的颜色外观、水凝胶的SRGB、鲑鱼鱼片的TVB-N含量如图4所示。指示水凝胶开始呈黄色，在第80天逐渐变为橙色(图4A)。同时，结果显示，鲑鱼在-20℃保存60 d后，SRGB值显著增加，建议的指示剂水凝胶的SRGB在保存80 d后增加到25.4%(图4B)。同时，将结果与国家标准检测TVB-N的方法进行了比较。TVB-N是鱼类在腐烂过程中逐渐产生的一系列含氮化合物，这些含氮化合物会导致包装环境pH值的升高。采集均匀化后的三文鱼片溶液中TVB-N的含量，如图4C所示。结果发现，鲑鱼鱼片中TVB-N的含量在贮藏初期为23.3 mg/100 g，在-20 ℃贮藏60 d后增加到32.9 mg/100 g。贮藏80 d后，TVB-N含量增加到48.7 mg/100 g。中国国家标准(GB 2733-2015)建议鲑鱼中TVB-N的食用限量为30 mg/100 g。将检测系统的SRGB值与TVB-N含量进行匹配，确定线性多项式模型和R2(模型的精度)。结果表明，鱼的SRGB值与TVB-N含量呈正相关，相关系数为0.959 6(图4D)。结果的高相关性表明，作者提出的指示水凝胶具有很好的监测新鲜度变化的潜力。有研究人员开发了一种基于淀粉-纤维素和茜素染料的pH敏感指示水凝胶，用于在室温下检测鱼类腐败。他们发现，指示剂水凝胶随着虹鳟鱼的变质表现出明显的颜色变化，茜素-淀粉纤维素指示剂的总色差(ΔE)与鱼类TVB-N含量的相关性较高，正相关系数为0.87。本文报道的指示水凝胶在相关系数上优于上述水凝胶。还有研究报道了茜素/醋酸纤维素纳米纤维指示水凝胶的颜色变化可以用来指示4 ℃下的鱼样品的新鲜度。通过与上述水凝胶型指标的比较，证明了ben指标水凝胶具有防冻性能，可以成功应用于低温条件下的新鲜度监测。这解决了传统指示剂水凝胶在低温运输或储存过程中因形成冰晶而不能很好地指示新鲜度变化的问题。与TVB-N法相比，作者的水凝胶不需要复杂的样品前处理，不需要专业的设备和人员。结果表明，该指示剂水凝胶可用于开发智能水产品保鲜包装。

04 Conclusion

以茜素和两性离子材料为原料，制备了一种新的比色新鲜度指示水凝胶。在低温条件下，它表现出良好的抗冻性和与水产品新鲜度相关的明显颜色变化。结果表明，Z-H在低温下仍保持了良好的力学性能和稳定性。指示水凝胶对NH3表现出比色响应。此外，指示水凝胶对低温环境下保存的鲑鱼具有指示新鲜度的能力，其结果与经典的TVB-N方法具有较高的相关性。本研究为开发具有抗冻性能的指示水凝胶提供了一种新的途径，并为在低温下无损在线监测鱼类新鲜度提供了一种灵敏的方法。

通信作者简介

王彦波，男，1978年1月生，山东东营人，博士，教授，博士生导师，曾在美国佛罗里达大学（University of Florida, UF）从事博士后研究，现任北京工商大学食品与健康学院院长，兼任中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程专业委员会常务理事、中国食品科学技术学会第三届青年工作委员会委员、全国特殊膳食标准化技术委员会委员、中国生物工程学会食品生物技术专业委员会委员等，期刊《Food Science and Human Wellness》、《食品科学》、《食品工业科技》、《食品研究与开发》等编委。入选国家“万人计划”领军人才，科技部创新人才推进计划、浙江省高等学校优秀青年教师资助计划、浙江省151人才工程培养人员、浙江省高等学校中青年学科带头人等。

Colorimetric indicator based on zwitterionic anti-freezing hydrogel and alizarin for visual monitoring of salmon fillets freshness

Yanan Liu^a, Huan Li^a, Jian Chen^a, Jiesi Feng^a, Renjie Lian^b, Linglin Fu^a, Yanbo Wang^a,c,^*

^a Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China

^b Jinghai Group Co., Ltd., Rongcheng 264300, China

^c School of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China

*Corresponding author.

Abstract

Indicating hydrogels have shown the advantages of being fast, sensitive, and real-time in demonstrating the freshness of aquatic products due to their noticeable color change. In this work, an anti-freezing hydrogel embedded with pH-sensitive alizarin was developed as an original colorimetric indicator for monitoring the corruption of aquatic products at low temperatures. The anti-freezing hydrogel was prepared from 2-carboxyethyl acrylate, [2-(methacryloyloxy)ethyl]-trimethylammonium chloride, and 2-hydroxyethyl methacrylate monomers with triethylene glycol dimethacrylate as cross-linking agent. The hydrogel showed excellent anti-freezing capability, which was further incorporated with the pH-sensitive dye alizarin to gain the indicating capability. When applied in the indication of the freshness of salmon under low-temperature storage, it was found that the color changes of the indicator corresponded with the total volatile basic nitrogen contents of salmon, the correlation coefficient of which was 0.959 6. These results indicated the application potential of the hydrogels as freshness indicators during low-temperature storage or cold-chain transportation.

Reference:

LIU Y N, LI H, CHEN J, et al. Colorimetric indicator based on zwitterionic anti-freezing hydrogel and alizarin for visual monitoring of salmon fillets freshness[J]. Journal of Future Foods, 2024, 4(2): 135-141. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.06.004.