2025-05-24
第二届未来食品科技创新国际研讨会分-分会场六∣食品装备与智能制造专场
2025-05-24
第二届未来食品科技创新国际研讨会分-分会场五∣综合报告五
2025-05-24
第二届未来食品科技创新国际研讨会分-分会场四∣综合报告四
2025-05-24
第二届未来食品科技创新国际研讨会分-分会场三∣综合报告三
Introduction
神经退行性疾病是一类与年龄相关的疾病，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS），其特点是神经结构和功能的退化，导致认知障碍和运动改变等症状。现有的治疗方法包括乙酰胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂，但维持氧化还原平衡成为新的研究方向。目前，许多关于神经退行性疾病治疗的研究都集中在维持氧化还原稳态上，因为氧化/硝化应激以及基因突变可以增强蛋白质聚集体的产生。此外，线粒体功能失调和蛋白质聚集体的形成可由外部应激源(如污染、阳光、吸烟等)和内部因素(如自由基的代谢产生)诱导。线粒体功能障碍通常在神经退行性疾病的早期发现，并通过引起ATP缺乏和改变ATP依赖的生化级联反应，促进这些退行性过程的进展。受损的线粒体表现为谷胱甘肽过氧化物酶活性降低和谷胱甘肽水平降低。此外，线粒体DNA的突变和线粒体复合物I、II、III和IV的缺陷已在多种神经退行性疾病和衰老过程中被发现。既有的治疗方式在保持氧化还原平衡方面存在问题，需要研究新的方法解决该治疗方式存在的问题。
4-羟基肉桂酸(HCA)(图1A)，又称对香豆酸，是由肉桂酸(图1B)通过4-肉桂酸羟化酶或酪氨酸解氨酶由l-酪氨酸(图1C)合成的一种植物化学物质，存在于花生、西红柿、罗勒和胡萝卜等多种可食用植物中。目前，关于HCA是否可以保护与线粒体功能增强相关的神经元细胞尚未得到研究。
图1 HCA及其前体的化学结构:(A) HCA，(B)肉桂酸，(C) l -酪氨酸
Results and discussion
HCA诱导PM氧化还原酶表达，改变细胞氧化还原电位
分别培养了两种不同的神经细胞系SH-SY5Y和HT22，分别在HCA缺失和存在的情况下进行了免疫印迹分析，评估了它们的表达水平。在两种细胞系中，HCA均以剂量依赖的方式增加NQO1的表达(图2A和B)。相反，HCA没有显著增加SH-SY5Y细胞中b5R的表达(图2C)。HCA作用下SH-SY5Y细胞中A b5R活性有升高的趋势，但不显著。然而，HCA诱导HT22细胞中b5R的表达呈剂量依赖性，与b5R活性的增加一致(P < 0.01)(图2D)。经HCA处理的SH-SY5Y细胞的NAD+/NADH比值较对照细胞显著升高(约2~2.5倍)(P<0.01) (图2E)。在与HCA孵育的HT22细胞中，也发现有更高的NAD+/NADH比率(约2~3倍)(P<0.01)(图2F)。
图2. 诱导PM氧化还原酶的SH-SY5Y和HT22细胞的特征。细胞在没有或存在指示浓度(微摩尔)的HCA的情况下预先孵育24小时，用NQO1和b5R单抗对SH-SY5Y(A，C)和HT22细胞(B，D)的裂解产物进行免疫印迹分析。进行了三个独立的免疫印迹分析实验。NQO1活性(A，B)是在有或没有双香豆素的情况下用全细胞裂解物测定的。用这些裂解产物评估B5R活性(C，D)和NAD+/NADH比率(E，F)
HCA保护神经细胞免受毒性损伤
利用图3A和图3B中的HCA和siRNA片段设计了不同的NQO1表达模型。为了研究线粒体功能障碍是否也可以被诱导的PM氧化还原酶所减轻，我们用鱼藤酮(一种线粒体复合体I抑制剂)来诱导线粒体功能障碍。用鱼藤酮处理SH-SY5Y和HT22细胞后，细胞存活率显著降低，且呈剂量依赖性(P<0.01)(图3C~F)。然而，NQO1的高表达提高了线粒体功能异常下的细胞存活率，克服了能量代谢的缺陷(图3C~F)。将这两个细胞暴露于Aβ1-42可降低代谢活性(P<0.0 1)，这一作用不能被HCA处理减弱(图3G-J)。
图3. 添加有毒物质后，HCA对细胞活力的影响。免疫印迹法检测Hca和siRNA作用24 h(A、B)后NQO1表达水平。细胞预先与HCA共同孵育后，暴露于指示毒性物质(C-J)中24 h，台盼蓝拒染法(E，F)和四甲基偶氮唑盐比色法(C，D，G，H，I，J)检测细胞存活率。
HCA延缓细胞凋亡
在正常培养条件下(即不含鱼藤酮的培养液)，荧光显微镜显示SH-SY5Y和HT22细胞均有轻微的细胞萎缩(P<0.01)(图4A和图B)。鱼藤酮可加速细胞收缩(P<0.01)。添加HCA使细胞对鱼藤酮诱导的细胞形态改变具有抵抗作用(P<0.01)(图4A和B)。同样，在正常培养条件下，两个细胞都很少出现染色质凝集(图4C、D)。
图4.鱼藤酮治疗后HCA对细胞凋亡特征的影响。加入鱼藤酮24 h后，测定(A，C)SH-SY5Y；(B，D)HT22的细胞膜通透性(碘化丙啶阳性细胞)(A，B)和染色质凝集(C，D)水平。
HCA可减轻氧化/硝化损伤
与对照细胞相比，预先与HCA孵育的细胞中的8-异前列腺素水平并没有增加(图5A和B)。在鱼藤酮作用下，SH-SY5Y和HT22细胞的8-异前列腺素水平均显著升高(P<0.01)，但这些水平可被HCA以剂量依赖的方式减弱(图5A和B)。在正常培养条件下，HCA处理的SH-SY5Y细胞的蛋白质羰基水平略低于对照细胞(图5C和D)，这是蛋白质氧化的标志。在加入鱼藤酮后，对照细胞的蛋白质羰基水平显著增加，且呈剂量依赖关系(P<0.01)，而暴露于HCA的细胞中这些水平显著降低(P<0.01)(图5C和D)。在加入鱼藤酮后，对照组细胞中蛋白质硝化的生物标志物3-硝基酪氨酸水平也显著增加(P<0.01)(图5E和F)。然而，在HCA存在的情况下，这些水平在培养的细胞中降低(P<0.01)(图5E和F)。
图5在接触鱼藤酮后，HCA对脂质和蛋白质的氧化/硝化损伤水平的影响。(A，C，E)SH-SY5Y，(B，D，F)HT22分别作用24 h后，用细胞提取液检测8-异前列腺素(A，B)、蛋白质羰基(C，D)和硝基酪氨酸(E，F)水平。进行了六个独立的氧化/硝化损伤检测实验。
HCA不是直接的ROS清理者
为了检测HCA是否直接清除ROS，用过氧化氢进行了DPPH测定。在没有细胞的情况下，HCA本身并不降低ROS水平，而α-生育酚直接降低ROS水平。经鱼藤酮处理后，SH-SY5Y细胞产生的ROS水平显著增加(P<0.01)。在加入HCA的SH-SY5Y细胞中，上述水平较低(P<0.01)。然而，在添加2-DG后，这些水平没有显著变化。
HCA诱导的PM氧化还原酶抑制线粒体ROS的产生
在没有线粒体抑制剂的情况下，加入HCA可以降低SH-SY5Y和HT22细胞中的ROS水平(图6A-D)。经鱼藤酮处理后，两种细胞的ROS产生水平均显著升高(P<0.01)(图6A和B)。然而，与未加入HCA的细胞相比，加入HCA后，两种细胞内ROS水平的升高均降低(P<0.01)(图6A和图B)。此外，在活细胞中，仅用鱼藤酮处理的细胞线粒体超氧化物歧化水平升高，但经HCA处理后线粒体超氧化物歧化水平降低(P<0.01)。S2E-H)。SH-SY5Y和HT22经抗霉素A处理后，ROS水平也显著升高(P<0.01)(图6C和D)。但HCA的加入导致抗霉素A孵育的细胞产生较低水平的ROS(P<0.01)(图6C和D)。
图6. HCA对线粒体ROS产生的抑制作用。用HCA培养细胞，用离心法分离线粒体部分。在谷氨酸/苹果酸(A，B)或琥珀酸(C，D)存在的情况下，评估线粒体ROS的产生。(A，C)SH-SY5Y；(B，D)HT22
HCA诱导的PM氧化还原酶促进线粒体功能
测定线粒体复合物I和II以及APR的活性，以研究PM氧化还原酶调节神经元细胞线粒体功能的机制。当在HCA存在下以剂量依赖性方式培养时，SH-SY5Y细胞中的线粒体复合物I活性显着增加(P<0.01)（图7A）。暴露于鱼藤酮后，线粒体复合物I活性显着降低（P<0.01);然而，复合物I活性的抑制通过用HCA培养SH-SY5Y细胞而减弱(P<0.01)（图7A）。补充HCA的SH-SY5Y细胞中的复合物II活性也高于对照细胞(P<0.01)（图7C）。用鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞往往会降低复合物II的活性，但并不显着（图7C）。随着线粒体复合物I和II活性的增强，APR在HCA培养的SH-SY5Y细胞中也以剂量依赖性方式显着增加（P<0.01）（图7E).添加鱼藤酮后SH-SY5Y细胞中的APR降低，但在HCA存在下通过孵育减弱(P<0.01)（图7E）。类似地，HCA使HT22细胞中复合物I和II的活性高于正常培养条件下培养的对照细胞（图7B和D）。鱼藤酮降低了HT22细胞中的复合物I活性(P<0.01)，但通过用HCA培养细胞，复合物I活性降低了(P<0.01)（图7B）。HCA也增加了HT22细胞中的复合物II活性(P<0.01)，但活性没有被鱼藤酮显着改变(图7)D).APR在HT22细胞与鱼藤酮一起孵育后降低，加入HCA后APR大大升高（图7F）。
图7.HCA对线粒体功能的刺激。细胞与HCA预孵育，然后通过离心分离分离线粒体部分。在存在谷氨酸/苹果酸（A、B）和琥珀酸（C、D）的情况下测量线粒体复合物I和II的活性。还使用相同的电子供体谷氨酸/苹果酸(E)或琥珀酸(F)确定APR。(A,C,E)SH-SY5Y；（B、D、F）HT22。
HCA刺激线粒体融合并抑制线粒体分裂
监测Opa1和Mfn1（线粒体融合的生物标志物）和Drp1（线粒体裂变的标志物）以阐明NQO1或b5R的诱导调节线粒体伸长和断裂过程的机制。与正常培养条件下的对照细胞相比，补充HCA的SH-SY5Y细胞中Opa1和Mfn1的水平以剂量依赖性方式显着升高（图8A）。相反，SH-SY5Y细胞中的Drp1水平因暴露于HCA而显着降低（图8A）。类似地，用HCA处理HT22细胞会诱导更高的Opa1和Mfn1表达以及更低水平的Drp1（图8B）。
Conclusion
HCA是一种对线粒体功能具有神经保护作用的药物，可诱导PM氧化还原酶的表达并提高线粒体的复合物活性，从而降低线粒体的氧化和硝化应答，提高细胞存活率。因此，HCA可能是治疗神经退行性疾病的有效方法之一。
此文献探讨了4-羟基肉桂酸(HCA)的潜在神经保护作用，HCA是一种在多种食物和药物内合成的植物化学物质，具有抗炎和抗氧化应激的保护作用，对与氧化损伤相关的疾病如脑缺血再灌注损伤、II型糖尿病、肥胖等具有保护作用。本研究旨在研究HCA在调节神经细胞的线粒体功能方面的作用。作者使用SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系和HT22小鼠海马神经元细胞系培养24小时，评估HCA对有毒损害中PM氧化还原酶的表达和线粒体功能的神经保护作用。实验结果显示，HCA可诱导NQO1和b5R的表达，调节线粒体复合物、提高神经元对有毒刺激的存活能力和降低对细胞的氧化和硝化应答，可能通过提高细胞能量代谢和氧化还原状态，提高细胞对抗氧化应激的能力，改善线粒体功能。本文研究还显示，HCA能够通过调节线粒体融合和分裂等方式，维持线粒体结构和正常功能。本研究表明，HCA是一种潜在的对线粒体功能具有神经保护作用的药物，在治疗神经退行性疾病中具有潜在治疗价值。
4-Hydroxycinnamic acid attenuates neuronal cell death by inducing expression of plasma membrane redox enzymes and improving mitochondrial functions
Sujin Parka,1, Yoon A Kima,1, Jaewang Leea, Hyunsoo Seoa, Sang-Jip Namb, Dong-Gyu Joc, Dong-Hoon Hyuna,*
a Department of Life Science, Ewha Womans University, Seoul 03760, South Korea
b Department of Chemistry and Nano Science, Ewha Womans University, Seoul 03760, South Korea
c School of Pharmacy, Sungkyunkwan University, Suwon 16419, South Korea
*Corresponding authors.
Abstract
Many approaches to neurodegenerative diseases that focus on amyloid-β clearance and gene therapy have not been successful. Some therapeutic applications focus on enhancing neuronal cell survival during the pathogenesis of neurodegenerative diseases, including mitochondrial dysfunction. Plasma membrane (PM) redox enzymes are crucial in maintaining cellular physiology and redox homeostasis in response to mitochondrial dysfunction. Neurohormetic phytochemicals are known to induce the expression of detoxifying enzymes under stress conditions. In this study, mechanisms of neuroprotective effects of 4-hydroxycinnamic acid (HCA) were examined by analyzing cell survival, levels of abnormal proteins, and mitochondrial functions in two different neuronal cells. HCA protected two neuronal cells exhibited high expression of PM redox enzymes and the consequent increase in the NAD+/NADH ratio. Cells cultured with HCA showed delayed apoptosis and decreased oxidative/nitrative damage accompanied by decreased ROS production in the mitochondria. HCA increased the mitochondrial complexes I and II activities and ATP production. Also, HCA increased mitochondrial fusion and decreased mitochondrial fission. Overall, HCA maintains redox homeostasis and energy metabolism under oxidative/metabolic stress conditions. These findings suggest that HCA could be a promising therapeutic approach for neurodegenerative diseases.
