食品界

FSHW | 一种适冷动性球菌来源的丝氨酸蛋白酶的系统功能分析及应用前景

Introduction

蛋白酶是一种重要的水解酶，在洗涤剂、食品、纺织、制药、多肽合成等工业领域占据着举足轻重的地位，占据了世界各地市销酶总量的近60%的市场份额。冷活性蛋白酶一般来源于嗜冷菌，具有低温催化效率高、结构灵活等优势。目前发现，冷活性蛋白酶的应用非常广泛，包括用于冷洗工业的洗涤添加剂、肉类嫩化和其他食品工业的加工，在这些应用中，该酶表现出极大的节能特性，并具有改善冷藏肉类的口感和风味的特性。

鱼类因其丰富的蛋白质、必需氨基酸和多不饱和脂肪酸等对人体健康有益的营养成分而受到消费者的青睐，成为日常饮食的一部分。近年来，随着水产养殖和渔业链条的不断发展，鱼类产品的年产量有了显著的增长，但同时也产生了许多副产品，未得到充分利用或被丢弃。这些副产品可能被用作生产附加值产品的来源，如蛋白质水解物和生物活性肽。

因此，江苏大学-食品与生物工程学院-水产科学与健康课题团队高瑞昌教授等在本研究中，旨在研究蛋白酶PmSpr288水解鲢鱼肉蛋白的性能，并评价其酶解产物的生物活性功能，以期为蛋白质水解工业领域提供一种潜在的性能良好的低温生物催化剂。

图1 研究设计

Results and Discussion

序列分析及同源建模

利用NCBI ORF查找工具对编码PmSpr288的基因进行ORF检测，发现该基因长990 bp，编码一个多肽，推断分子量为35.3 kDa。利用S8家族的肽酶构建的系统发育树（图2a）显示PmSpr288与Planococcus属处于同一簇。值得注意的是，Planococcus丝氨酸肽酶S8（WP 068488733）与PmSpr288的进化关系最为密切。保守结构域分析表明，PmSpr288的催化中心由氨基酸残基Asp49、His86和Ser251组成，Ile129、Leu146和Asn168是其他活性位点。综上所述，生物信息学分析表明PmSpr288是S8超家族中的一个肽酶。

图2 系统进化树与同源建模

PmSpr288在鲢鱼蛋白水解中应用

水解研究发现，PmSpr288对肌球蛋白和肌原纤维蛋白具有相当高的蛋白水解活性（图3）。随着酶促反应结束，肌球蛋白重链（220.0 kDa）、肌动蛋白（44.3 kDa）和肌球蛋白轻链（21.0 kDa）等条带的强度明显消失。然而，没有观察到低分子量蛋白条带的积累，这意味着高分子量蛋白被高效降解为富含多肽和氨基酸的水解产物。PmSpr288对鱼蛋白的主要成分肌球蛋白和肌原纤维蛋白具有极高的水解能力，为该酶在鱼产品加工工业中的应用提供了进一步的支持，如制备生物活性肽。

图3 鲢鱼肌球蛋白和肌纤维蛋白的水解产物分析

酶与底物的结合机制分析

从图4a可以看出，对蛋白酶和肌动蛋白结合过程有利的氨基酸被标记（Agr215、Asn224、Asp227、Tyr282、Thr289和Asn301；通过氢键连接的Tyr143、Glu167、Lys284、Asp286、Gln354和Lys 373）（黄色）在2.07～3.85 Å之间，盐桥（粉色）在2.1～3.98 Å之间。同样，PmSpr288与肌球蛋白的分子对接结果（图4b）表明，其结合过程主要是通过氢键进行的，氢键可以增强PmSpr288-肌球蛋白复合物的稳定性，从而促进蛋白酶与蛋白底物的结合和水解。此外，蛋白酶与蛋白质底物之间氢键的形成是确定底物中蛋白酶精确切割位点的关键步骤，这为阐明蛋白质从特定的柔性区域开始，然后逐渐降解为多肽和氨基酸的蛋白质水解过程提供了系统的分析方法。综上所述，分子对接结果表明，结合区这些关键氨基酸残基形成的氢键是促进酶-底物复合物结合的主要力量，有助于PmSpr288对蛋白质的水解过程。

图4 酶与底物蛋白酶的分子对接

水解条件优化及产物分析

水解条件经响应面优化后，蛋白质水解产物中多肽的分子量分布见表1。蛋白质水解产物中低分子量（＜1000 Da）肽的含量为99.44%。其中，180～500 Da占10.06%，180 Da以下占89.38%。上述结果表明，PmSpr288能够水解鲢鱼肌肉蛋白并产生多种多肽，为PmSpr288在生物活性多肽生产中的应用提供了理论依据。

表1 鲢鱼肌肉蛋白水解物中多肽的分子量分布

Conclusion

本研究获得了一种对鱼肉蛋白具有良好水解性能的低温碱性蛋白酶（PmSpe288）。该酶与鱼肉肌动蛋白和肌球蛋白的结合过程很大程度上是通过氢键进行的，这有助于底物蛋白的水解。PmSpr288制备的鲢鱼水解液含有大量的低分子量肽，具有良好的抗氧化活性。因此，考虑到生物技术或生物制品中对性能良好的酶的需求日益增长，本文的研究结果将为其在生产生物活性肽的实际应用，如从鱼中生产抗氧化肽、降血压肽的研究提供理论基础。

第一作者

冷伟军，江苏大学食品与生物工程学院2021届博士研究生，研究方向为食品微生物与酶工程，硕博师从高瑞昌教授，目前以第一作者在Food Science and Human Wellness, Journal of the Science of Food and Agriculture, Foods等期刊发表研究型论文SCI 3篇，申请中国发明专利1项。

通信作者

高瑞昌，江苏大学食品与生物工程学院教授，博导。国家现代农业产业技术体系岗位科学家，江苏省“333”、“六大人才高峰”高层次人才，江苏大学食品生物工程与智能装备方向带头人，中国生物工程学会理事，中国食品科技学会青年工作委员会委员。长期从事食品蛋白质加工与综合利用、水产食品组分与营养功效和食品风味化学等领域研究，主持与参与国家自然科学基金等项目20多项。Trends in Food Science & Technology、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Journal of Agricultural and Food Chemistry，Food Chemistry，Food & Function发表SCI论文100多篇。授权国家发明专利17件，申请国家发明专利38件，授权美国、日本专利各1件；获江苏省科技进步奖等省部级和市厅级奖励5项。《Food Biotechnology International》编委、《未来食品科学》编委、《食品科学》编委和《肉类研究》编委。

Systematic functional analysis and potential application of a serine protease from cold-adapted Planococcus bacterium

Weijun Leng^a, Xiaoyun Wu^a, Xianghui Qi^a, Hongying Liu^b, Li Yuan^a,*, Ruichang Gao^a,*

^a School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

^b Ocean College of Hebei Agriculture University, Qinhuangdao 066000, China

*Corresponding authors.

Abstract

In this study, a gene encoding serine protease (PmSpr288) from cold-adapted bacterium, namely Planococcus maritimus XJ11, was cloned and overexpressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Bioinformatics analysis revealed that PmSpr288 belongs to serine protease S8 superfamily with a classical catalytic triad comprised by the Asp49, His86 and Ser251. Moreover, PmSpr288 was found to be active over broad alkaline pH and low-moderate temperature, and exhibited wide range of protein substrate specificity. In addition, PmSpr288 was able to hydrolyze the meat proteins actin and myosin, and molecular docking results suggested that the crucial interaction between PmSpr288 and actin/myosin complexes was mainly occupied by hydrogen bonds. The muscle protein hydrolysates of silver carp prepared by PmSpr288 was shown to have antioxidant activity via DPPH radical scavenging assay, which presented an IC₅₀ valve of 1.309 mg/mL. In conclusion, these characteristics imply that PmSpr288 has potential biotechnological application prospect for the production of bioactive peptides.

Reference:

LENG W J, WU X Y, QI X H, et al. Systematic functional analysis and potential application of a serine protease from cold-adapted Planococcus bacterium[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1751-1761. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.025.