食品界

Introduction

食品过敏原的快速准确检测对食品安全至关重要。在170种过敏性食物中，花生和大豆会引起约90%的过敏症状，例如血压升高、呼吸困难、咳嗽、哮喘，甚至有休克和死亡的风险。花生和大豆是两种最危险的食物过敏原，它们的普遍性、持久性和严重性不容小觑。与牛奶和鸡蛋等其他高过敏性食物相比，花生引起的过敏通常是终身的。大豆也很容易引起过敏。全世界约0.3%的成年人和13%的儿童对大豆过敏。因此，开发一种敏感、特异的花生、大豆等植物过敏原检测方法具有重要意义。

环介导等温扩增检测技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的基本检测原理是：在靶标存在的情况下，根据靶标序列六个特异区域设计的引物（四条或者六条）在Bst DNA聚合酶的链置换作用以及聚合作用下进行反应，在一个小时内实现大量扩增。LAMP方法具有极高的特异性及灵敏度，而且所需设备简单、反应时间短，在病毒、细菌、过敏原等检测领域受到广泛应用。LAMP技术虽应用广泛，但在扩增过程中易出现引物二聚体及引物错配，产生假阳性结果。

Cu-TCPP纳米片是一种以铜离子（金属节点）和四（4-羧基苯基）卟啉为有机配体的2D-MOF纳米片，具有良好的生物相容性与可降解性。Cu-TCPP纳米片还具有高比表面积与大量的表面活性位点等优异的特性，对荧光具有良好的猝灭能力，可以有效降低传感器的噪声，提高传感灵敏度。在这篇文章中，首次利用Cu-TCPP纳米片对单链DNA的吸附作用，将纳米片加入LAMP扩增体系中抑制非特异性扩增，建立了具有高特异性的基于Cu-TCPP纳米片的LAMP检测方法（Cu-TCPP@LAMP），并将该方法用于检测花生与大豆过敏原基因。

图1 Cu-TCPP@LAMP系统扩增反应示意图

Results and Discussion

Cu-TCPP纳米片对引物的吸附作用

将Cu-TCPP纳米片与花生过敏原LAMP引物进行孵育，每隔10 min测量一次纳米片的紫外吸光度值，图2A结果显示，在Cu-TCPP纳米片溶液中加入单链引物后，其吸收峰发生红移，并且随着混合时间的延长，红移后的吸收峰值逐渐增强，表明引物可以有效吸附在Cu-TCPP纳米片上。进一步将不同浓度的Cu-TCPP纳米片与标记有荧光基团的单链探针进行孵育，并对其荧光值进行测量。结果如图2B所示，随着Cu-TCPP纳米片浓度的增加，单链探针的荧光值越来越小。Cu-TCPP纳米片可以将单链探针吸附在纳米片表面上，致使单链探针的荧光发生猝灭。

图2 Cu-TCPP纳米片对引物的吸附作用

Cu-TCPP纳米片添加量的筛选

向LAMP体系中加入1 μL不同浓度的Cu-TCPP纳米片后对花生和大豆过敏原基因进行检测。图3显示，当检测花生和大豆的LAMP体系中分别含有900 ng 和1400 ng的Cu-TCPP纳米片时，LAMP体系具有良好的扩增且没有非特异性扩增的产生。这一结果在不同合成批次的Cu-TCPP纳米片也保持一致。

图3 LAMP扩增反应中Cu-TCPP纳米片添加量的筛选

扩增反应温度的筛选

因为在经典反应体系中增加了Cu-TCPP纳米片，反应温度对被Cu-TCPP吸附的引物扩增效率也可能产生意想不到的影响。图4A和B显示63 ℃时荧光强度最高，但对于花生和大豆两种不同的过敏原，希望能够建立一种通用的反应温度，以便于操作人员和机器的识别。图4C比较了两种不同对象间不同反应温度下Ct值距离的远近，65 ℃的反应温度下两者的Ct值差值最小，是符合期望的反应温度。

图4 Cu-TCPP@LAMP扩增温度的筛选

镁离子浓度的筛选

镁离子的浓度对酶和引物的扩增效率至关重要。图5显示6 mmol/L的Mg²⁺确实是个不错的选择。

图5 Cu-TCPP@LAMP镁离子浓度的筛选

引物浓度的筛选

为了让添加的Cu-TCPP纳米片能有效吸附体系中的引物，减小引物二聚体产生的可能。从引物浓度下手看看体系中不同浓度引物会带来怎么样的结果：0.01 nmol/L的引物已经不能引发扩增，而超过0.2 nmol/L的引物则可能导致了二聚体的产生。

图6 Cu-TCPP@LAMP引物浓度的筛选

Conclusion

Cu-TCPP@LAMP方法也成功通过了本设计的针对特异性、重复性和灵敏度的测试。这一方法能检测出最少5 ng/μL的花生过敏原以及10 ng/μL的大豆过敏原。但过敏原检测往往面对的是复杂的深加工食品，使用Cu-TCPP@LAMP方法检测了市面上能够获得的含有花生和大豆的各类深加工食品，单盲测试中所有含有花生和大豆的食品均被检出，展示出Cu-TCPP@LAMP方法强大的应用潜能。

图7 使用Cu-TCPP@LAMP方法检测实际商品

表1 使用Cu-TCPP@LAMP方法检测市售产品的测试结果

第一作者

高家乐，男，理学硕士在读。主要研究方向为动物疫病、核酸检测方法的开发及应用研究。

孙晓东，男，药物分析学博士，硕士生导师。主要从事基于新材料的分离分析方法和核酸检测方法的开发及应用研究。现为中国药理学会分析药理学会青年委员，宝山科协委员。主持和参与国家自然基金青年项目、国家自然基金面上项目、上海市扬帆计划项目、上海市高校青年教师培养资助计划（重点推荐）、江苏省自然科学基金等课题多项。以第一作者或通讯作者发表SCI论文16篇，代表性论文发表在Separation and Purification Technology、Microchimica Acta、Microchemical Journal、Journal of Chromatography A、Analytical and Bioanalytical Chemistry、Electrophoresis等杂志上。

通信作者

陈沁，女，博士，教授，博士生导师，上海市植物生理学会副理事长，校研究生院招生办公室主任，曾任上海大学生命科学学院副院长。主要从事生化与分子生物学相关交叉领域的研究，包括1）过敏原的检测方法及致敏机理研究；2）II型糖尿病治疗药物的发现机理研究；3）动物疫病和食品安全预警方法的研究等。曾获上海市育才奖、宝钢优秀教师奖、国家质检总局科技兴检奖、上海大学三八红旗手、上海大学青年教师教学竞赛三等奖、上海大学教学名师等。主持和参与科技部、国家自然科学基金、上海市科委、教委和农委科研项目及横向项目20余项。先后在Food Chemistry，European Journal of Medicinal Chemistry等专业期刊上发表论文100多篇，申请专利10项，授权专利2项；担任NOTULAE BOTANICAE HORTI AGROBOTANICI杂志的编委。

方雪恩，男，博士，复旦大学化学系分析化学副教授。主要从事微流控芯片系统和病原微生物核酸分子恒温扩增等领域的工作。曾获上海浦江人才项目资助、上海市优秀技术带头人称号。

Ultrathin metal-organic framework nanosheets (Cu-TCPP)-based isothermal nucleic acid amplification for food allergen detection

Jiale Gao^a,1, Xiaodong Sun^b,1, Yongxin Liu^a, Bing Niu^a, Qin Chen^a,*, Xueen Fang^c,*

^a Shanghai Key Laboratory of Bio-Energy Crops, School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China

^b Shanghai Engineering Research Center of Organ Repair, School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China

^cDepartment of Chemistry and Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

¹ Both authors contributed equally.

*Corresponding authors.

Abstract

The rapid and accurate detection of peanuts and soybeans allergen is important to the food safety. In this study, Cu-TCPP nanosheet, a kind of ultra-thin metal-organic framework (MOF) was synthesized and applied in loop-mediated isothermal amplification (named Cu-TCPP@LAMP), which can inhibit the non-specific amplification by absorbing and precise temperature releasing of single primer. As thus, Cu-TCPP@LAMP can achieve high sensitivity and specific amplification of the target gene. As a result, peanut and soybean allergens genes contained in food were successfully detected with a favorable detection sensitivity (5 ng/μL for peanuts and 10 ng/μL for soybeans) and reliable repeatability (The coefficient of variation was 3.38% for peanuts and 3.33% for soybeans). Moreover, the established method was utilized for detection of several commercial products, and had a high consistency with the standard method. Apart from food allergens, this novel assay can be widely used in other areas, such as pathogen detection, tumor nucleic acid detection and so on.

Reference:

GAO J L, SUN X D, LIU Y X, et al. Ultrathin metal-organic framework nanosheets (Cu-TCPP)-based isothermal nucleic acid amplification for food allergen detection[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1788-1798. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.031.