食品界

FSHW | 酶解技术助力蜂王浆高值化利用-酶解对蜂王浆蛋白结构及抗氧化性能的影响

Introduction

蜂王浆是工蜂分泌的浆状物质，因其营养和功能活性而受到广泛关注。蛋白质是蜂王浆的重要组成成分，占蜂王浆的9%～18%，富含丰富且均衡的必需氨基酸，被视为蜂王浆中的独特的生物活性成分。蜂王浆蛋白质主要由王浆主蛋白构成，约占82%～90%，具有免疫调节、降压、抗炎、抗菌等多种生物活性。

据报道，酶解技术可以通过改变蛋白质性质，以获得更高的营养及功能活性。目前已有研究主要集中于蜂王浆蛋白水解物的制备及应用，如蛋白酶-N、胃蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶所制备的蜂王浆蛋白水解液，在体外和体内均显示出相对较强的抗氧化活性，可能是由于酶解增加了生物活性肽的数量和种类。然而，由于目前研究中水解时间差异较大，难以确定酶解时间与水解度的联系。另一方面，以往研究主要集中于水解产物的生物活性，而对其结构特征的研究较少，因此难以建立酶解产物结构与功能的关系。此外，蛋白酶是水解蛋白质的主要手段之一，其中碱性蛋白酶是一种来自地衣芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶，被视为获得生物活性肽的较为高效的蛋白酶之一，目前仅有少数研究将其用于制备蜂王浆蛋白来源的抗氧化肽。因此，应用碱性蛋白酶酶解蜂王浆蛋白，并探究水解液的结构与功能特性很有意义。

浙江大学动物科学学院李珊珊副研究员、胡福良教授和爱尔兰农业部Teagasc国家食品研究中心马晓彬博士等在本文采用碱性蛋白酶水解蜂王浆蛋白来获得生物活性肽，通过比较不同水解度的酶解产物的结构特征和体外抗氧化活性，最终确定蜂王浆蛋白生物活性肽生产的最佳水解时间，为蜂王浆蛋白酶解条件的选择、生物活性水解产物的设计提供参考，并为蜂王浆蛋白酶解产物结构与功能关系提供理论依据。

Results and Discussion

蜂王浆蛋白酶解时间优化

为了构建有效的蜂王浆蛋白酶解技术，研究了蜂王浆蛋白经碱性蛋白酶水解，在不同酶解时间的水解度。如图1所示，蜂王浆蛋白随着酶解时间的增加，水解度不断增加，在8 h时达到最大。在最初的1 h内，水解度增加最显著，达到15.19%，在之后的7 h内，水解度逐渐增加至23.91%。这说明高效酶解能够在短时间内完成，并且不能维持较长时间。一方面，在初期，溶解性较差的蜂王浆蛋白转化为可溶性形式，促进酶分子向底物渗透，加速酶促反应。另一方面，碱性蛋白酶的反应稳定性较差，在长时间的反应中酶活性降低；并且随着反应的进行，蛋白底物中的可达裂解位点减少。随着越来越多的蜂王浆蛋白被降解为小肽，酶分子与合适底物的接触频率降低，从而阻碍了酶促反应。

图1 蜂王浆蛋白水解液的水解度

蜂王浆蛋白酶解液的抗氧化活性

本文选择了5个具有代表性的水解度：5.34%（RJPH5，0 min），11.65%（RJPH12，15 min），15.19%（RJPH15，1 h），21.38%（RJPH21，5 h）和23.91%（RJPH24，8 h），进行抗氧化活性和结构特性的解析（图2）。与蜂王浆蛋白（RJPH5）相比，所有酶解产物（RJPH12、RJPH15、RJPH21和RJPH24）均表现出更高的抗氧化活性，这表明碱性蛋白酶水解是增强蜂王浆蛋白抗氧化活性的有效方法。这可能是碱性蛋白酶水解蜂王浆蛋白可以释放出更多的生物活性肽，从而提高蜂王浆蛋白水解物的抗氧化活性。另一方面，抗氧化活性呈现水解度依赖不断增加，并且在5 h内抗氧化活性增加较快，5 h后增加趋势开始趋于平缓，说明5h后，碱性蛋白酶的酶活性降低，进而降低了生物活性肽的生成效率。

图2 蜂王浆蛋白水解液的抗氧化活性

蜂王浆蛋白水解液的结构

为了进一步探明蜂王浆蛋白抗氧化活性增加的原因，通过分子量分布、傅里叶变换红外光谱、二级和三级结构、表面疏水性和表面形态学等指标，解析了蜂王浆蛋白水解液的结构。结果表明，随着水解度的增加，蜂王浆蛋白水解液的分子量显著降低（图3），表明碱性蛋白酶有效地水解了肽键，将大分子裂解为更小的片段，但是水解也是有限度的，进一步延长水解时间及增大水解度并不能将大分子量组分进一步转化为更小分子量组分。傅里叶变换红外光谱显示蜂王浆蛋白的初级结构并未改变（图4），而二级结构分析表明，酶解使得蜂王浆蛋白内部的α-螺旋减少，而β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构增加。随着水解度的增加，蜂王浆蛋白水解液的表面疏水性和内源荧光密度显著降低（图5和图6），并且内源荧光发生了红移（图5）。蜂王浆蛋白水解液表面形态从紧密的片状结构逐渐被水解成疏松的微小颗粒（图7）。这些结果表明，适度酶解可以使得蛋白质结构更加伸展，破坏肽键，暴露出更多酶的结合位点，从而进一步促进蛋白质的水解，释放更多的生物活性肽，从而增强水解物的抗氧化活性。

图3 蜂王浆蛋白的分子量分布

图4 蜂王浆蛋白水解液的傅里叶变换红外光谱图

图5 蜂王浆蛋白水解液的内源荧光图谱

图6 蜂王浆蛋白水解 液的表面疏水性

图7 蜂王浆蛋白水解液的表面形态

Conclusion

本文比较了水解程度对蜂王浆蛋白结构与功能的影响，研究发现蜂王浆蛋白水解液的水解度呈现时间依赖性不断增加，抗氧化活性呈现水解度依赖不断增加。蛋白结构方面，随着水解度的增加，蛋白质分子量降低，初级结构未发生改变，而内部的α-螺旋减少，β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构增加。与蜂王浆蛋白相比，蜂王浆蛋白水解液的表面疏水性和内源荧光密度显著降低，内源荧光发生红移，其表面形态也从较大的蛋白质结构转化为更小的蛋白质片段。但是也许是由于碱性蛋白酶效率随着反应时间延长而降低，这些变化在水解度大于20%时呈现不显著的变化。综合酶解效率和产量，蜂王浆蛋白的最佳酶解时间为5 h。

第一作者

李珊珊，女，农学博士，浙江大学特聘副研究员。主要研究方向为蜂产品功能、加工与质量控制。一直从事功能性食品与人类健康的研究，围绕蜂产品（蜂王浆、蜂胶、蜂花粉等）的特点，利用分子和细胞生物学、分析化学、组学结合生信分析等技术，建立蜂产品的质量控制技术,系统解析蜂产品中活性成分改善人体健康的分子机制。主持国家自然科学基金、中国博士后科学基金特别资助和面上资助等科研项目5项。近5年来，在国际权威期刊发表论文20余篇，其中第一作者身份在Food Chemistry, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, Food Research International, Food & Function等杂志发表。

通信作者

胡福良，男，理学博士，教授，博士生导师，国务院政府特殊津贴专家。研究方向为蜜蜂、蜂产品及功能性食品科学。现任浙江大学蚕蜂研究所所长，动物科学学院学术委员会主任；兼任中国养蜂学会副理事长，中国蜂产品协会顾问，浙江省蜂业学会理事长，国家蜂产业技术体系产品加工研究室主任、岗位科学家。先后主持国家自然科学基金、科技部、教育部、浙江省等各级各类课题60余项；获国家技术发明二等奖2项、国家科技进步三等奖1项、省部级奖6项；获得授权国家发明专利40项；制订国家及行业标准10项；主编、副主编著作10部；发表学术论文400余篇。

马晓彬，女，工学博士，爱尔兰农业部Teagasc国家食品研究中心玛丽居里博士后。主要研究方向为食品酶解、蛋白质与多糖相互作用及食品组分超声波加工。主持欧盟玛丽居里学者项目、国家自然科学基金、中国博士后科学基金等科研项目4项。近5年来在Food Hydrocolloides, Food Chemistry, Ultrasonics Sonochemistry, Carbohydrate Polymers 等国际权威期刊发表论文30余篇。

Structural and antioxidative properties of royal jelly protein by partial enzymatic hydrolysis

Shanshan Li^a, Lingchen Tao^a, Shiqin Peng^a, Xinyu Yu^a, Xiaobin Ma^b,*, Fuliang Hu^a,*

^a Key laboratory of silkworm and bee resource utilization and innovation of Zhejiang Province, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

^b Teagasc Food Research Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork P61 C996, Ireland

*Corresponding authors.

Abstract

The objective of this study was to investigate the structural and antioxidative properties of royal jelly protein (RJP) at different degrees of hydrolysis (DH) by partial enzymatic hydrolysis. RJP was hydrolyzed by alcalase for 0 min, 15 min, 1 h, 5 h and 8 h to obtain hydrolysates at DH of 5.34%, 11.65%, 15.19%, 21.38% and 23.91%, respectively. With the increased DH, the RJP hydrolysates showed elevated antioxidative activities. The molecular weight of RJP hydrolysates was significantly decreased but their primary backbone kept unchanged. Analysis of circular dichroism spectra revealed that the enzymolysis reduced the content of α-helix but increased the contents of β-sheet, β-turn and random coil. Meanwhile, the surface hydrophobicity and fluorescence intensity of RJP hydrolysates were decreased and a red shift occurred. As the enzymolysis continued, the surface morphology of RJP was gradually changed from a sheet-like structure into microparticles. Changes in antioxidative activities and structures generally followed a DH-dependent manner, however these changes became insignificant for samples at DH beyond 20%. Taking into consideration of both effectiveness and productivity, the optimum enzymatic duration was determined at 5 h.

Reference:

LI S S, TAO L C, PENG S Q, et al. Structural and antioxidative properties of royal jelly protein by partial enzymatic hydrolysis[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1820-1827. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.046.