纯牛乳是我国居民摄入乳制品的主要形式，其摄入量占比达到60%。然而，货架期内牛乳的蛋白水解会引起偶然的产品苦包和蛋白絮凝，严重影响消费者的饮乳体验和消费欲望。纤溶酶活性占总蛋白酶活性的60%左右。纤溶酶所引起的酪蛋白水解是超高温（UHT）灭菌乳在贮存期间出现凝胶和苦味的主要原因。
尽管纤溶酶水解酪蛋白对乳酪最终风味和质量有着积极的影响，但其诱导老化凝胶严重限制了牛乳产品的货架期。蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司杨晋辉、钱文涛*和内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司的李洪亮等对牛乳中纤溶酶系组分、纤溶酶诱导牛乳老化凝胶、影响纤溶酶活性的因素和纤溶酶的检测方法进行综述，以期为牛乳纤溶酶的深入研究提供参考。
纤溶酶系统是一套复杂的相互调节的蛋白调节系统，其组成包括纤溶酶、纤溶酶原、纤溶酶原激活剂、纤溶酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制因子，其相互之间的调节关系如图1所示。
牛乳中纤溶酶为碱性丝氨酸蛋白酶，分子质量为48 kDa，在pH 7.4～7.5和37 ℃条件下表现出最佳的类似胰蛋白酶活性。牛乳中纤溶酶主要以纤溶酶原形式存在，纤溶酶原为糖基化蛋白质，由786 个氨基酸残基组成，分子质量为88 kDa。纤溶酶原有5 个典型的环饼状结构域，每个结构域有3 个二硫键参与维持结构稳定，如图2A所示，这些结构域含有对赖氨酸亲和力不同的结合位点，在调节酶原激活方面发挥重要的作用。
如图2A所示，纤溶酶原激活剂也属于碱性丝氨酸蛋白酶，通过水解纤溶酶原的环饼状结构域5（K5区）与催化结构域之间的Arg557-Ile558来激活酶原；此外，纤溶酶通过自催化剪切纤溶酶原Lys77-Arg78部分，释放出77 个氨基酸残基的预活化肽后，剩余Arg-纤溶酶原构象发生改变，更容易被激活剂所激活。图2B显示纤溶酶也可以催化纤溶酶原激活剂由单链转化为双链，极大提高激活剂的催化活性。牛乳中纤溶酶原激活剂主要有两种，分别为组织型和尿激酶型。组织型激活剂来源于血液转运，其活性与纤维蛋白数量显著相关，与酪蛋白相连接；而尿激酶型激活剂来源于淋巴细胞的分泌，与生乳中的体细胞相连接。尿激酶型激活剂可以从体细胞解离，并通过赖氨酸或静电作用与酪蛋白相结合。
纤溶酶原激活剂抑制因子和纤溶酶抑制剂均属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，分别抑制酶原激活剂和纤溶酶，两者均分布在乳清相中，活性受pH值和温度影响较大。牛乳中鉴定出多种丝氨酸蛋白酶抑制剂，α2-抗纤溶酶被认为是主要的纤溶酶抑制剂。 牛乳的凝胶老化主要是由乳清蛋白中的β-乳球蛋白（β-lg）和酪蛋白中κ-酪蛋白（CN）相互结合形成三维网络结构的过程，表现为牛乳黏度上升和蛋白絮凝。老化凝胶的形成主要分为3 个阶段：1）热加工过程中，β-lg和κ-CN内的二硫键发生分子间交联，形成β-lg-κ-CN复合物，并附着在酪蛋白胶束表面；2）货架期内，附着在酪蛋白胶束表面的β-lg-κ-CN复合物缓慢解离到乳清相中；3）乳清相中β-lg-κ-CN复合物形成交联，并与蛋白结合在一起。根据凝胶机理不同，牛乳的老化凝胶分为酶促凝胶和非酶凝胶，酶促凝胶是指由蛋白酶水解酪蛋白颗粒，将β-lg-κ-CN复合物释放到乳清中，彼此交联形成凝胶。不同来源蛋白酶诱导牛乳老化凝胶差异比较如表1所示。非酶凝胶则是由于贮存过程中，解离κ-CN的胶束会由于重力作用缓慢聚集（储存时间超过货架期）形成凝胶。除蛋白酶外，影响牛乳老化凝胶的因素还包括乳牛泌乳、热加工强度和贮存温度等，产品中盐类添加剂会延迟或加速凝胶出现。
纤溶酶对赖氨酸和精氨酸具有亲和性，可水解Lys-X和Arg-X键，优先水解含赖氨酸的肽键，其对酪蛋白组分的水解优先顺序为β-、αs2-和αs1-CN，而对κ-CN和乳清蛋白的水解程度较小，对不同酪蛋白的水解位点和水解产物如表2所示。研究表明乳糖基化赖氨酸的形成会抑制纤溶酶的水解作用。琥珀酰化赖氨酸同样阻止了纤溶酶对β-CN的识别结合作用，因此，酪蛋白中完整赖氨酸残基结构对于纤溶酶水解至关重要。
有学者将纤溶酶诱导凝胶形成过程分为以下几个阶段：1）纤溶酶快速水解β-和αs-CN；2）酪蛋白之间的疏水互作、酪蛋白与磷酸钙的结合力、酪蛋白与离子盐之间的相互作用，均明显减弱，酪蛋白胶束微观结构破坏；3）酪蛋白微观结构发生重排，形成凝胶网络结构，出现表观凝胶现象；4）纤溶酶继续水解酪蛋白胶束，表观上形成半透明清亮液体。 纤溶酶通过水解αs-CN和β-CN使得乳脂球表面的酪蛋白胶束结构解体，从而导致乳脂球相互融合、上浮，在产品表面形成乳油层。牛乳中纤溶酶和纤溶酶原的添加可降低牛乳乳油层的硬度，增加其延展性，并增强感官指标中的结构和表观特性。 不同品种泌乳动物之间乳中纤溶酶活性存在差异。牛乳中的纤溶酶及其酶原的活力会也受到乳牛品种的影响，不同乳牛品种间纤溶酶含量的差异可能与乳中酪蛋白相关，通过调整合成底物和酪蛋白比例以消除酪蛋白干扰后，品种间的纤溶酶活性差异得以抵消。泌乳阶段和胎次
随着泌乳期的推进，乳牛乳腺的血乳屏障受损，上皮细胞通透性增加，来自血液的纤溶酶原和激活剂数量增加，纤溶酶原活化比例增加，导致泌乳后期通常伴随着较高的纤溶酶活性。然而，绵羊乳中纤溶酶活性的变化与乳牛并不一致，泌乳初期或中期绵羊乳中纤溶酶、酶原和酶原激活剂活性要高于泌乳后期。水牛乳中也有相类似的趋势。与泌乳阶段变化相似，泌乳动物胎次的增加也会导致乳腺组织不可逆损伤程度增加，通透性增加，从而导致乳中纤溶酶活性可能随胎次增加而逐渐增加。纤溶酶活性随乳牛胎次呈二次性变化，第2、3胎乳牛的纤溶酶活性高于初产和第4胎乳牛，此外经产绵羊乳中纤溶酶活性是初产绵羊乳的1.5～2.2 倍。 在体细胞数低于50万 个/mL和高于100万 个/mL的两个绵羊群比较中，高体细胞数羊乳中的纤溶酶活性显著高于低体细胞数羊乳，纤溶酶原也具有类似的变化，但会受到泌乳阶段的影响。有关乳牛的研究也表明，体细胞数和纤溶酶活性呈显著正相关（相关系数0.567），但与纤溶酶原活性的相关性不显著（相关系数为－0.516）。炎症可诱导活化的免疫细胞分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂，促进纤溶酶原向纤溶酶的转化，纤溶酶活性增加。与低体细胞数（＜30万 个/mL）绵羊乳相比，高体细胞数使得纤溶酶原激活剂和纤溶酶活性显著增加，纤溶酶原活性无显著变化，纤溶酶原/纤溶酶比值下降。尿激酶型酶原激活剂能够从体细胞上解离下来，并与酪蛋白相结合，而牛乳中的体细胞数、体细胞在牛乳中的时长以及牛乳的热处理等因素，都能影响该解离过程。微生物酶
生乳中的嗜冷菌在贮运过程所分泌的蛋白酶具有干扰纤溶酶系统的作用。荧光假单胞杆菌所分泌的胞外蛋白酶会引起纤溶酶从酪蛋白胶束解离到乳清相中，从而影响牛乳产品特性。乳房链球菌在感染期间能分泌的PauA和PauB也表现出纤溶酶原激活剂的活性。由大肠杆菌分泌的大肠杆菌素能够有效抑制丝氨酸蛋白酶的水解作用，其对血液蛋白酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂表现出抑制作用。多黏芽孢杆菌分泌的蛋白酶能够水解纤溶酶原，形成类似纤溶酶的水解活性。 如前所述，二硫键在维持纤溶酶、酶原及其激活剂的空间构象和催化活性方面起着重要作用。β-lg是牛乳乳清蛋白的主要成分，其受热变性后释放游离巯基，通过分子间二硫键交联来抑制纤溶酶活性，而天然的β-lg对纤溶酶也表现出抑制作用；对β-lg的游离巯基进行修饰后，其对纤溶酶的抑制作用消失。在同样的加热条件下，随着体系中β-lg含量的增加，纤溶酶和纤溶酶原的残留活性逐渐降低。乳清蛋白表现出对纤溶酶原激活剂活性的促进作用，天然、变性的α-la处理组以及变性β-lg处理组的酶原激活速率常数分别是对照组的7.07、2.85 倍和2.27 倍。完整的酪蛋白胶束结构能够发挥位阻效应，保护纤溶酶免受β-lg的抑制作用。加工工艺对纤溶酶体系的影响与乳清蛋白和酪蛋白胶束变化均有关系。热处理
由于纤溶酶系组分的耐热性有所不同，不同加热条件下，最终所表现出的纤溶酶活性会有所不同。巴氏杀菌（75 ℃、15 s）条件下，纤溶酶抑制剂耐热性优于纤溶酶原激活剂抑制因子。巴氏杀菌热处理（72～75 ℃、15 s）或直接UHT前的预处理（80～85 ℃、30 s）可灭活牛乳中的纤溶酶原激活剂抑制因子和纤溶酶抑制剂，减少对酶原激活的抑制和纤溶酶的抑制作用，使得牛乳在货架期内的纤溶酶活性上升。相比之下，纤溶酶、酶原及其激活剂的耐热性较高，如表3所示。纤溶酶的活性在不同的温度区间段表现不同：纤溶酶原的变性温度为50～62 ℃，此温度区间内加热，部分环饼状结构域展开造成构象改变，暴露出Lys77-Arg78，使得纤溶酶原更容易被激活；纤溶酶从65～70 ℃开始逐渐灭活；巴氏杀菌加热段区间（75～85 ℃）纤溶酶及其酶原的失活被纤溶酶原激活所掩盖；在90 ℃左右，纤溶酶活性迅速降低；而95 ℃以上时，纤溶酶活性缓慢降低。温度低于90 ℃时，酶活性呈现出温度依赖性；温度高于90 ℃，酶活性与加热维持时间有关。纤溶酶在90 ℃上下表现出不同的变化可能涉及不同的灭活机制，这与β-lg中活性巯基对纤溶酶及其酶原的影响有关。温度在低于和高于90～95 ℃各温度段中，β-lg变性的限速反应分别为肽链展开和蛋白聚集，这与纤溶酶活性随温度变化的趋势相印证。与组织型激活剂相比，尿激酶型激活剂的催化活性更高。
当高压加工压力小于300 MPa时，牛乳中纤溶酶活力降低幅度低于10%；但当加工压力为400 MPa时，纤溶酶活力残留70%～75%；加工压力为600 MPa时，纤溶酶残留活力为25%～36%，并且随着加工时间的延长，残留活力会逐渐降低。高压导致酪蛋白胶束崩解，纤溶酶原和纤溶酶均释放到乳清相中，尽管结构破坏的酪蛋白更易被纤溶酶水解，然而释放到乳清相中的纤溶酶也更容易被抑制剂所抑制，因此高压处理并未导致酪蛋白水解程度的增加。室温下600 MPa高压处理的纤溶酶活性并未降低，而较高温度下的高压处理会促进纤溶酶失活：与室温处理相比，60 ℃高压加工纤溶酶的失活率达到86.5%。与β-lg相比，纤溶酶及其酶原对加工压力的耐受性较高，压力低于600 MPa的加工条件下纤溶酶失活率低于50%，压力低于500 MPa的加工下纤溶酶原失活率低于20%。 传统的均质加工也能降低纤溶酶活力（降幅 达 40 % ～ 46 % ）和纤溶酶原衍生活力（降幅达46%～54%）：随着均质压力（50～100 MPa）的提高，纤溶酶活性灭活率提高；此外，分段高压均质比单阶段的高压均质灭活率更高。膜浓缩
利用超滤膜浓缩牛乳生产乳酪时，天然乳清蛋白被浓缩，纤溶酶活性受到抑制，β-和α-CN的水解程度降低。当用渗滤去除乳清蛋白后，纤溶酶的浓缩比显著高于纤溶酶原、酪蛋白或脂肪；渗滤过程中纤溶酶原和纤溶酶抑制剂的浓缩影响了纤溶酶的活性，β-lg和α-la浓度下降时，纤溶酶活性增加，纤溶酶活性与β-lg和α-la的浓度间接相关。 热处理后纤溶酶原的激活通常发生在货架期内，纤溶酶活力需要3 d至数周时间达到最大；随着贮存时间的延长，纤溶酶因自水解或活性的不可逆抑制而出现活性下降。但也有学者报道，直接UHT牛乳在货架期（10～120 d）内纤溶酶活性伴随着αs1-CN含量的下降而增加。冷藏时温度越低，酪蛋白胶束中胶体磷酸钙溶解增加，乳清相中Ca2＋浓度增加，纤溶酶原的活化和纤溶酶活性增加，乳清Ca2＋有可能通过竞争性抑制机制来影响纤溶酶原激活剂对酶原的亲和力。 牛乳中外源添加4、8、12 U/L的纤溶酶后，室温条件下分别贮存5、4、3 周时便会出现凝胶，而在高温贮藏条件下凝胶会提前1～2 周出现。脱脂乳中添加2.5 U/L纤溶酶在37 ℃贮存3 周后，出现了链状蛋白团聚和纤维状蛋白桥，而在23 ℃条件下仅出现蛋白颗粒凝集；当外源纤溶酶添加量增加至15 U/L时，23 ℃贮存3 周后出现致密的蛋白网络结构，当贮存温度升至37 ℃时，蛋白网络结构解体。。 纤溶酶的水解活力既可以通过检测蛋白水解度及其水解产物来确定，也可以直接测定。可以通过检测水解肽段、蛋白条带以及pH 4.6下可溶非蛋白氮或游离氨基酸含量的变化来判定蛋白水解发生程度。有研究比较了三硝基苯磺酸（TNBS）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）、凝胶电泳和荧光胺4 种方法检测纤溶酶水解牛乳的灵敏性：TNBS、荧光胺和RP-HPLC等方法对pH 4.6下可溶物和6%三氯乙酸可溶物中的检测结果呈现较高的相关性（r＞0.93），凝胶电泳适用于定性分析，荧光胺的检测限最低，RP-HPLC检测灵敏度最高，从检测准确性、可靠性和便捷程度考虑，推荐TNBS作为常规实验室检测纤溶酶活力的方法。高分辨超声光谱也被用于开发检测纤溶酶诱导的β-CN水解，非线性反应曲线与经典的逆米氏模型曲线趋于一致。
纤溶酶原的检测方法与纤溶酶相一致，先检测样品中纤溶酶活力，然后向样品中加入酶原激活剂进行孵育，孵育后再次进行纤溶酶活力检测，两次纤溶酶活力检测值之差即为纤溶酶原衍生活力。有研究将夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）应用于乳中纤溶酶及其酶原的检测，方法的线性范围低至5～75 ng/mL，变异系数为5%～8%，不需要预处理即可检测，且与其他乳蛋白不存在交叉反应，但由于酪蛋白的干扰作用，检测准确率较低（60%～90%）。为避免酪蛋白的干扰，可以用柠檬酸钠或ε-氨基己酸将纤溶酶解离到乳清中进行测定；为避免乳清中纤溶酶抑制剂对纤溶酶活力检测的影响，可以用超速离心将酪蛋白和乳清蛋白分离后再检测。表4列出最近关于纤溶酶检测生物传感器的报道，均是基于纤溶酶对底物的特异性剪切，通过引起光、电、机械振动或表面张力等信号的变化进行检测，检测限可以达到0.032～0.860 nmol/L。
纤溶酶是牛乳中最主要的内源蛋白酶，其对液体乳产品质量有着重要的影响。巴氏杀菌乳在低温下冷藏且销售周期短，间接UHT产品中纤溶酶灭活程度较高，两类产品出现纤溶酶诱导的老化凝胶风险较低；而直接UHT产品中蛋白变性程度较低，纤溶酶残留活性较高。随着消费者对乳中活性物质关注度的上升，活性蛋白保留成为了乳品工艺改良的新方向。乳清蛋白和美拉德反应对纤溶酶活性具有抑制作用，因此，如何在最大程度保留活性蛋白和减少美拉德反应的同时，抑制纤溶酶的水解作用，成为了乳品加工工艺优化，特别是直接UHT工艺改良的重要课题。目前纤溶酶的检测方法主要在实验室研究阶段，生物传感器等快速检测方法离商业应用尚有一段距离，开发纤溶酶的快速检测方法对于产品的线下检测和快速诊断有着重要的意义。因此，针对纤溶酶的灭活工艺优化和快速检测应该成为乳业研究的重要课题，而纤溶酶的调控和作用机制也需进一步明确，为保证牛乳产品质量夯实理论基础。
本文《牛乳纤溶酶及其活性影响因素研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷第13期235-243页，作者：杨晋辉,钱文涛,李洪亮,等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220531-379。
