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《食品科学》:西北农林科技大学刘延琳教授等:葡萄酒中生物胺的研究进展
2023-11-06作者:来源:责任编辑:食品界 字体A+AA-
葡萄酒口感复杂多样,香气优雅浓郁,备受消费者的青睐。其中微生物在葡萄酒质量风格塑造中发挥着极其重要的作用,如果发酵控制不当,则会产生威胁葡萄酒饮用安全的不良代谢物,其长期过量摄入可能会触发相关疾病。葡萄酒中不良代谢物主要包括氨基甲酸乙酯(EC)、生物胺(BA)、赭曲霉毒素A(OTA)等。生物胺(BA)是一类具有生物活性、含氨基的低分子质量有机化合物的总称,在活细胞中具有重要的生理功能,具备清除自由基等代谢活力,但过量摄入则会引起头疼、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应,严重时还会危及生命。
1 葡萄酒中主要的BA
目前葡萄酒中检测出的BA共20余种,包括腐胺、组胺、酪胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、精胺、亚精胺、甲胺、乙胺、异戊胺等,其中组胺、酪胺和腐胺含量最高,相关研究也最为广泛。组胺是葡萄酒中公认毒性最强的BA,许多国家对葡萄酒中组胺的含量已有明确限定(表1),其中德国和荷兰最为严苛,限量为2 mg/L。我国尚未明确对葡萄酒中BA的限量要求。在葡萄酒中,酪胺能促进体内去甲肾上腺素的释放,其毒性仅次于组胺。适量的酪胺经肠道吸收后被单胺氧化酶氧化和分解,过多摄入则会造成积累,从而引起偏头痛等不良反 应。腐胺是葡萄酒中最普遍存在的BA,几乎在所有葡萄酒中都能够检测到,虽然其毒性较组胺而言更低,但其能抑制相关AOs活性,减少AOs对组胺、酪胺的分解,导致组胺和酪胺含量积累、毒性增强。因此,腐胺的大量积累也会对机体造成间接损害,引起不适。同腐胺一样,尸胺、精胺、亚精胺等BA尽管没有直接毒性作用,但在一定条件下,它们的存在也能够与亚硝酸盐反应积累致癌物质亚硝基胺。因此,严格控制葡萄酒中BA种类与含量对于酿造健康的高品质葡萄酒具有积极的作用。
2 葡萄酒中BA的来源
葡萄酒中的BA主要来源于发酵过程中微生物的代谢,微生物产生的底物特异性脱羧酶能催化相应的前体氨基酸合成BA。这些前体氨基酸既可能来源于葡萄浆果,又可能通过微生物在自身溶解酶的作用下释放产生。因此,葡萄酒中BA含量主要取决于原料中前体氨基酸含量组成及微生物对其的代谢能力。此外,还有少数BA在葡萄生长过程中因应对氮过量或缺乏等环境而产生,随机械处理(除梗、破碎)后的原料进入葡萄酒中。如葡萄酒中被广泛报道的组胺、腐胺和酪胺,以及甲胺、乙胺、苯乙胺、异戊胺和尸胺均少量存在于葡萄汁(醪)中。葡萄酒中BA信息及其来源总结见表2。
3 葡萄酒中主要BA的生成及调控机制
4 葡萄酒中参与合成BA的微生物
葡萄酒中BA的产生与发酵微生物脱羧酶基因的存在与否具有较强的相关性,一般不含hdc、tdc和odc基因的菌株不具备产生组胺、酪胺、腐胺的能力,具有较高的安全性。
4.1 酵母菌
关于AF期间酵母菌能否合成BA尚存争议。以Delr等为代表的绝大多数研究者发现AF结束后BA含量并无显著变化。但也有少数研究指明一些酵母菌株在AF过程中能够合成BA,且合成BA的能力存在菌株特异性。
4.2 乳酸菌
AF结束后,乳酸菌通常作为MLF的发酵剂分解L-苹果酸,降低葡萄酒的酸涩感,在MLF完成后,葡萄酒中的BA水平普遍存在不同程度的升高。因此,目前的主流观点认为乳酸菌是葡萄酒中产生BA的主要微生物。此外,值得注意的是,在一些产组胺和酪胺的乳酸菌中,其HDC和TDC活性由多个基因簇协同调控,进而催化游离的氨基酸生成BA并分泌至胞外。
4.3 其他微生物
葡萄酒酿造体系是一个极其复杂的混菌发酵系统,系统内微生物群落结构复杂,除酵母和乳酸菌外,其他发酵微生物能否合成BA基本处于研究空白阶段。
4.4 葡萄酒中合成BA微生物的检测
在此基础上开发的多重PCR技术可同时检测能合成多种BA的微生物。相比之下,该方法特异性强、成本低、耗时短、可同时扩增多个DNA片段,能够广泛应用于BA微生物溯源的检测中。随着分子生物学的发展和检测技术的提高,利用实时定量PCR技术也能实现对BA微生物溯源的定量检测。
5 BA的检测方法
6 葡萄酒中BA的影响因素及其控制方法
在葡萄酒生产过程中,BA含量始终呈现动态变化。除少量存在于葡萄原料中的BA外,其主要形成于葡萄酒发酵和贮存阶段。BA的形成一般需要3个条件:一是游离的前体物质;二是具备氨基酸脱羧酶的微生物;三是适宜的环境条件。因此影响葡萄酒中BA含量的主要因素包括:1)葡萄原料,即游离氨基酸;2)葡萄酒微生物,即氨基酸脱羧酶及BA降解酶;3)工艺参数,即发酵工艺。发酵过程中,可根据葡萄酒中BA的相关影响因素,采取相应的策略(图2)来控制其含量。
6.1 葡萄原料的优选
葡萄原料中游离氨基酸蓄积量随着品种、成熟度、产地、年份、气候等多重因素的不同呈现显著差异,进而影响发酵后葡萄酒中BA的种类及组成,从而影响最终葡萄酒中BA的含量。选择成熟度和卫生状况良好葡萄浆果,不仅能够充分保障发酵的顺利进行,提高葡萄酒香气的纯净度,还能减少具有合成BA潜力的杂菌侵染(图2)。
6.2 葡萄酒微生物的选择
微生物的选择是影响葡萄酒质量的关键因素,微生物代谢也是葡萄酒中BA的主要来源。葡萄酒中的BA主要由具有氨基酸脱羧酶的葡萄酒微生物代谢产生,不同菌株发酵的葡萄酒BA含量也存在差异,故在葡萄酒酿造过程中,接种不产生氨基酸脱羧酶或具有AOs活性的菌株是降低产品中BA含量最有效的方式(图2),前者可预防由葡萄酒微生物代谢导致的BA积累,后者能够实现对BA不同程度的降解。
6.3 优化发酵工艺
大量研究表明,葡萄酒中的BA主要来源于发酵过程,适宜的酿造工艺对于保证葡萄酒的安全性至关重要。如前文所述,少量BA和大多BA生物合成的前体氨基酸均存在于葡萄浆果中,故对葡萄原料进行除梗、破碎、压榨、澄清等工艺处理必然会影响上述物质在发酵基质中的含量,最终影响酒体中BA的含量。因此,选择合适的机械处理和澄清工艺可有效避免葡萄酒酿造过程中BA的积累。发酵温度也是影响葡萄酒中BA含量的重要因素之一,酸性环境有利于BA的生成。综上,在AF过程中,必须严格控制发酵条件,如机械处理强度、发酵温度和pH值,以减少这一过程中BA的积累。
对于不进行MLF的葡萄酒而言,可在AF结束后及时添加SO2、富马酸等化学抑制剂抑制乳酸菌的生长;而对于陈酿型葡萄酒,在二次发酵MLF结束后,因酒液中pH值升高及SO2含量较低,发酵基质中残余的一些微生物如乳酸菌仍具备氨基酸脱羧能力,可采用倒罐转罐、下胶、澄清或瞬时高温灭菌处理,以及添加乳酸链球菌素、片球菌素等细菌素及溶菌酶等及时清除乳酸菌,从而控制BA的含量(图2)。
结语
近年来,消费者对于葡萄酒质量安全的关注越来越多,BA含量对葡萄酒质量的影响也是葡萄酒研究的前沿热点之一,全球研究者以多个视角对葡萄酒中BA形成的机理展开研究,并获得了一系列重要的认知。目前普遍认为葡萄酒中BA主要由大多数的乳酸菌和少数酵母菌代谢合成,其检测主要依赖HPLC法,但该方法前处理繁琐复杂,因此探索简便快速、稳定灵敏、可靠的检测方法十分必要。葡萄酒中BA含量随原料、微生物、工艺等因素的变化而变化,据此可实施相应的葡萄酒工艺策略实现对BA含量的有效控制。其中合理使用菌株是控制葡萄酒中BA含量的重要手段,可采用多重PCR、实时定量PCR等分子生物学方法检测发酵体系中是否存在乳酸菌等葡萄酒微生物。此外,由于葡萄酒发酵体系微生物的高度复 杂性,当前对除酿酒酵母与乳酸菌外的其他微生物,如非酿酒酵母、醋酸菌等是否参与BA的合成还缺乏全面的认识,亟需进一步的探索,为控制葡萄酒BA含量提供更多思路。同时我国葡萄酒生产商应严格遵守相关国家标准,为消费者提供安全健康的葡萄酒产品,促进国产葡萄酒实现“量质并重”的战略转型。
作者简介
通信作者:
刘延琳,女,博士,教授,博士研究生导师,国内外知名葡萄酒专家,多项国际国内葡萄酒大赛评委。国家葡萄产业技术体系建设加工与贮运研究室主任、酿酒微生物岗位科学家。主要从事葡萄酒与酿酒微生物方面的教学、科研和推广工作,发表论文100余篇,其中高水平SCI科研论文20余篇。建立中国葡萄酒微生物资源库,保有资源逾万份。研发两个中国本土优良葡萄酒酵母菌种并进入工业化应用。科研获奖4 项,获批专利1 项。创建西北农林科技大学葡萄酒学院Tasting Panel葡萄酒专业品鉴平台。
第一作者:
史学荣,西北农林科技大学葡萄酒学院,在读硕士研究生。女,汉族,1997年11月06日出生于宁夏吴忠市。2020年毕业于宁夏大学葡萄酒学院葡萄与葡萄酒工程专业,获得工学学士学位。同年9月免试推送西北农林科技大学葡萄酒学院攻读硕士学位,师从刘延琳教授。研究方向为乳酸菌与酿酒酵母混菌发酵在葡萄酒增酸种的应用,主要研究方向为植物乳杆菌。