食品界

Introduction

全球老龄化的急剧增加引起了人们对其相关疾病的关注。痴呆症在老年人的慢性疾病中占有突出地位，尤其是阿尔兹海默氏病（Alzheimer's disease，AD）。AD的主要神经病理特征之一是淀粉样蛋白（Aβ42）的聚集和沉积，形成Aβ42寡聚体、纤维和淀粉样斑块。Aβ42的聚集体，尤其Aβ42寡聚体损害突触功能，导致脑神经细胞的死亡。许多研究表明，中枢神经系统中Aβ42清除率的降低可能是导致AD发生、发展的主要和/或起始原因。Aβ42的生理代谢发生在大脑和外周系统中。脑内的Aβ42可以通过多种机制被转运到外周系统，所以血液中Aβ42水平的降低必然会减少其在脑内的聚集和沉积。因此，清除外周Aβ42有助于减少大脑中Aβ42的沉积，减轻与AD相关的神经病变。开发能降低血液Aβ42聚集体的药物或制剂，如特异地抗Aβ42抗体或蛋白水解酶是一种可行的方法。

纳豆激酶（Nattokinase，NK）是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分泌的一种天然蛋白水解酶，其在胃肠道中具有较高的稳定性且对人体安全。纳豆激酶在体内外可催化各种蛋白聚集体的水解，对心血管健康有许多有利的影响，并可降低AD的发病率。然而，纳豆激酶在体内外捕获（结合和降解）Aβ42和Aβ40或其聚集体的功效以及对血液中Aβs水平的影响尚不清楚。

吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室张应玖教授课题组在本文中以纳豆激酶与Aβ42/Aβ40/Aβ35/Aβ28/Aβ9为研究对象，在分子水平和AD动物模型上研究了纳豆激酶捕获并催化不同种类淀粉样蛋白的有效性，以揭示纳豆激酶降低血液Aβ42/Aβ40水平的可能机制，并评价了其神经保护作用。

Results and Discussion

纳豆激酶与Aβ42三种典型形式的相互作用

分别测定了纳豆激酶对Aβ42单体、寡聚体和纤维的识别与结合功效。纳豆激酶能有效结合Aβ42寡聚体和Aβ42纤维，尤其是Aβ42寡聚体，但却结合较少的Aβ42单体。更重要的是，纳豆激酶能够在生理条件下缓慢催化Aβ42低聚物和Aβ42纤维的降解（图1）。

图1 纳豆激酶与Aβ42的相互作用

纳豆激酶对不同类型Aβ结合的特异性

分别测定了纳豆激酶与Aβ42、Aβ40、Aβ35、Aβ28和Aβ9等及其聚集体的结合特异性。结果表明，纳豆激酶对Aβ42和Aβ40的聚集体具有相对较高的结合特异性，而对C端截短的Aβ聚集体的结合特异性则较低（图2）。

图2 纳豆激酶与不同种类Aβ结合特异性分析

纳豆激酶对不同形式Aβ42的降解作用

纳豆激酶分别与Aβ42单体、寡聚体和纤维孵育1～9 d以研究其对Aβ42的降解作用。所有形式Aβ42均可被降解（图3A），其中纳豆激酶对Aβ42寡聚体的降解能力最强，对Aβ42纤维次之，对Aβ42单体最低。分别用抗Aβ42和抗纳豆激酶的抗体分析上述催化体系中Aβ42和纳豆激酶及其复合物的，结果表明：随着催化时间的延长，游离Aβ42和游离纳豆激酶分子逐渐减少，相应二者的多种复合物逐渐增加（图3B-G），这说明不同形式的Aβ42与纳豆激酶均有结合，并且催化降解产生了截短的Aβ片段。采用高效液相色谱法分析上述催化体系中纳豆激酶降解Aβ42所产生的片段（图3H-J）。催化产生的Aβ片段的保留时间介于Aβ28与Aβ35之间，推测可能为大约28到35个氨基酸残基的亲水性Aβ肽。不同保留时间的疏水组分可能是各种Aβ42聚集体（新形成的）或Aβ42(M/O)-纳豆激酶的复合物。综合以上分析得出，纳豆激酶对Aβ42寡聚体的催化作用最强。

图3 纳豆激酶催化Aβ42降解产物分析

纳豆激酶对AD模型小鼠血浆中Aβ42降解作用

分别在体内、体外测定了纳豆激酶对血液中Aβ42水平的影响（图4）。在体外，用纳豆激酶处理AD小鼠血浆样本，发现Aβ42/Aβ40的水平随着时间的推移而逐渐下降，尤其是在最初的9天，且显著依赖于纳豆激酶的活性（图4A）。对AD模型小鼠连续灌胃纳豆激酶14天后发现，所有纳豆激酶给药组小鼠的血液Aβ42/Aβ40水平均显著低于非给药组（阳性对照组）（图4B），表明纳豆激酶降低了AD小鼠血液中的Aβ42/Aβ40水平。纳豆激酶的体内催化能力也明显依赖于纳豆激酶的摄入量或其活性。对灌胃的纳豆激酶的总酶活力与剩余酶活力进行测定，结果表明，剩余的纳豆激酶活性仅占灌胃纳豆激酶总活力的一小部分（图4C），表明大部分纳豆激酶在摄取和/或进入血液过程中丢失了。尽管如此，进入血液系统的纳豆激酶也显示出良好的降解Aβ42/Aβ40的功效。

图4 纳豆激酶对AD模型小鼠血浆中总Aβs的影响

Conclusion

纳豆激酶可以捕获Aβ42/Aβ40及其聚集体，并通过复杂的机制缓慢催化它们的降解。纳豆激酶对Aβ42寡聚体的催化效率高于对Aβ42纤维和单体的。纳豆激酶对Aβ42/Aβ40聚集体的催化作用产生了亲水性的N末端片段和疏水性的C末端片段。同时，我们的研究结果也表明，口服的纳豆激酶进入血液后可有效降低血液Aβ42/Aβ40水平。因此，纳豆激酶是一种可行的血液Aβ42/Aβ40清除剂，具有预防与治理AD的潜能。

第一作者

倪爱新，女，吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，博士研究生，导师为张应玖教授，主要研究方向为酶功能调节与神经损伤修复。

通信作者

张应玖，女，吉林大学生命科学学院、分子酶学工程教育部重点实验室酶工程教授，博士生导师。曾赴美国耶鲁大学(Yale University)-斯坦福大学（Stanford University)开展博士后研究。张应玖教授长期从事分子酶学、神经生物学领域的研究，主要研究方向为酶分子功能及其调控机制、脑损伤与修复的分子机制。作为项目负责人已主持国家863计划项目1项，国家自然基金项目3项、省部级重点项目3项，以及其他可科技项目共约二十项，并已在《Nature》等国内外学术刊物上公开发表学术论文100余篇，著作四部，已获发明专利授权10项。

Degradation of amyloid β-peptides catalyzed by nattokinase in vivo and in vitro

Aixin Ni^a, He Li^a, Ruya Wang^a, Rentong Sun^a, Yingjiu Zhang^a,b,*

^a Key Laboratory for Molecular Enzymology and Engineering of the Ministry of Education, Jilin University, Changchun 130012, China

^b School of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China

*Corresponding author.

Abstract

Amyloid-β 1-42 (Aβ42) plays a pivotal role in Alzheimer disease (AD) pathogenesis. Peripheral clearance of Aβ42 largely affects its level in the brain and affects AD progression. Although nattokinase (NK) degrades Aβ40, the details of NK’s capture of various Aβ species and reduction of plasma Aβ42/Aβ40 are uncharacterized. In this study, the Aβ42/Aβ40-degrading ability of NK was investigated using five Aβs and AD model mice. The C-terminal region of Aβ42/Aβ40 (Gly29 to Val40) was primarily required for NK capture, and the integrated conformation in Aβ42/Aβ40 aggregates was a more efficient target for NK catalysis. Further, suspended Aβ42/Aβ40 oligomers were more easily captured by NK than suspended Aβ42/Aβ40 fibrils, while deposited Aβ42/Aβ40 fibrils recruited more NK than deposited Aβ42/Aβ40 oligomers. Although most NK was likely lost during NK uptake and/or entry into the blood, a small fraction of NK showed good plasma Aβ42/Aβ40-degrading efficacy after entering the blood due to NK’s stability in the plasma of AD mice for at least 9 days. It was concluded that oral administration of NK is a feasible approach for peripheral Aβ42/Aβ40 clearance. This implies that NK might serve as an anti-Aβ42 agent for the treatment of Aβ42/Aβ40-related diseases such as AD.

Reference:

NI A X, LI H, WANG R Y, et al. Degradation of amyloid β-peptides catalyzed by nattokinase in vivo and in vitro[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1905-1916. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.042.