为此中国检验检疫科学研究院的杨艳歌、王迎春、吴亚君等开展了以下实验研究：1）比较市场常见的试剂盒、传统CTAB法以及MPI指定的DNA提取试剂盒对麦卢卡蜂蜜花粉沉淀的DNA提取效果；2）建立麦卢卡蜂蜜上清液DNA提取方法，以弥补以往研究仅对麦卢卡蜂蜜花粉沉淀进行鉴别的不足；3）建立植物内参照、麦卢卡、卡奴卡3 种物种源性成分鉴别的real-time PCR方法，分析方法的特异性、灵敏度与检出限；4）比较本研究与MPI规定的方法对蜂蜜样品的检测效果。通过以上4 个方面的研究，建立了高效提取麦卢卡蜂蜜沉淀和上清液DNA的方法；提供了可快速、灵敏、准确鉴别麦卢卡蜂蜜植物源性成分的方法；并通过对比，证实了建立方法的可行性、准确性与等效性，以期为快速检测麦卢卡蜂蜜的真伪提供技术支撑。

以上述47 种植物为检测对象，分别对设计的麦卢卡和卡奴卡引物探针进行扩增，结果显示如图1B和图1C所示，这两组引物探针分别仅能对麦卢卡和卡奴卡进行有效扩增，Ct值分别为18.14±0.02和19.41±0.04，二者之间无交叉扩增，其他植物源成分无非特异扩增，说明设计的两组引物探针的特异性较好，可以进行蜂蜜样品中麦卢卡和卡奴卡成分的检测。

将6 个质量浓度梯度的麦卢卡和卡奴卡DNA进行绝对灵敏度检测，结果显示6 个梯度均有明显的扩增，当DNA质量浓度为1 pg/μL时，尚有良好的扩增，此时平均Ct值分别为35.66±0.13、37.02±0.42、36.27±0.29，因此初步确定内参照、麦卢卡和卡奴卡的绝对灵敏度均为1 pg/μL，结果如图2所示。根据仪器自动生成的标准曲线Y_内参照=-3.315X＋23.662、Y_麦卢卡=-3.434X＋25.800、Y_卡奴卡=-3.880X＋23.533，内参照、麦卢卡和卡奴卡引物探针灵敏度检测的扩增效率分别达100.298%、95.507%、81.019%，线性相关系数R2分别为0.999、0.998和0.995，说明线性关系良好，结果可信。因此确定本研究设计的内参照、麦卢卡和卡奴卡引物探针检测的绝对灵敏度最低可达1 pg/μL。与MPI报道的检出限为3 fg/μL，Ct值为36的灵敏度相近。

蜂蜜上清液DNA提取

为对有可能添加麦卢卡花粉到非麦卢卡蜂蜜进行冒充的情况进行鉴别，本研究又针对麦卢卡蜂蜜上清液建立了DNA提取方法。经实验，发现采用Promega Wizard^TM Magnetic食品DNA纯化系统可对麦卢卡蜂蜜上清液进行DNA提取，并采用该方法对MPI提供的15 份蜂蜜样品上清液进行DNA提取，并与MPI规定的Geneaid蜂蜜基因组DNA提取试剂盒的沉淀效果进行比较，结果发现建立的蜂蜜上清液DNA提取方法可以成功将所有蜂蜜DNA提出，可以满足检测要求，但与沉淀的扩增效果相比，上清液扩增效果略低于沉淀，扩增Ct值在24～36之间，沉淀DNA扩增Ct值在22～32之间，扩增结果如图5所示。

为分析本研究建立的方法对麦卢卡及卡奴卡蜂蜜检测的实际检出限，分别提取模拟制备的混合蜂蜜样品的上清液和沉淀DNA，并进行real-time PCR扩增，检测结果如图6所示。结果发现无论上清液还是沉淀，本研究建立的内参照、麦卢卡、卡奴卡成分检出限均可达0.1%。

采用本研究建立的方法以及MPI规定的麦卢卡蜂蜜DNA检测方法，对MPI提供的15 份蜂蜜进行DNA提取和扩增效果比较，详情见表2。检测结果显示3 种DNA提取方法均可获得质量良好的DNA，本研究建立的方法以及MPI规定的麦卢卡蜂蜜DNA检测方法检测结果一致，包括以下几种情况：1）3 份检出卡奴卡成分，其中1 份未检出麦卢卡成分，另2 份样品采用MPI方法平均Ct值为33.84±1.20和34.46±2.54，接近于MPI文件要求的Ct≤36.00的检测阈值，但其相对分析误差（RPD）分别为5%和14.76%，MPI文件规定测试结果RPD应小于5%，因此该结果应判为阴性。采用本研究方法，沉淀和上清液均未检出麦卢卡，因此这2 份样品非麦卢卡蜂蜜。2）1 份检出植物成分，但既未检出麦卢卡成分也未检出卡奴卡成分，为其他植物蜂蜜。3）9 份同时检出麦卢卡分和卡奴卡成分，为多花麦卢卡蜂蜜。4）2 份检出麦卢卡分而未检出卡奴卡，应为单花麦卢卡蜂蜜。综上，这15 份样品中，13.33%为麦卢卡单花蜜，66.67%为杂花蜜，13.33%为卡奴卡蜂蜜，6.67%为其他植物蜂蜜。

NucleoSpin食品基因组DNA提取试剂盒、Geneaid蜂蜜基因组DNA提取试剂盒、天根植物基因组DNA提取试剂盒、CTAB法4 种方法都能提出DNA，即在对麦卢卡蜂蜜检测的过程中并非必须用其指定的或进口的试剂盒，国产试剂盒和传统CTAB法也可满足要求，若想获取高质量浓度的DNA，在使用的过程中可通过采用增加蜂蜜样品量，富集花粉沉淀的方法获取DNA，从而提高检测效率。

同时，本研究对蜂蜜沉淀进行DNA提取的过程中，还对部分步骤进行改良，即增加了对花粉沉淀水洗的过程。这是因为基因组DNA也是糖，将蜂蜜中富集的沉淀增加水洗的过程，可以尽可能去除蜂蜜中的糖分，以避免在DNA提取的过程中造成干扰，从而提高DNA的提取效率。

此外，为谋取利益，造假者可能将麦卢卡花粉添加到非麦卢卡蜂蜜中以假冒麦卢卡蜂蜜，所以仅仅对蜂蜜中的花粉沉淀进行检测尚有不足。为此，本研究还建立了麦卢卡蜂蜜上清液DNA提取方法，并通过对15 份蜂蜜样品的实际检测，证实本方法可以有效提出蜂蜜上清液DNA。但同时研究结果显示，利用磁珠法提取的蜂蜜上清液的DNA扩增效率低于花粉沉淀，推测原因可能是蜂蜜样品中含有较多的糖分，会对磁珠溶液的分散体系造成影响，从而干扰了磁珠对DNA的吸附效率。但蜂蜜上清液DNA提取方法的建立弥补了以往蜂蜜蜜源植物成分溯源时仅对花粉沉淀进行检测的不足，从而能够分辨通过掺入花粉到糖浆中的造假蜂蜜。