食品界

芹菜素，一种天然类黄酮，在体内和体外促进人子宫内膜癌(EC)石川细胞自噬和铁死亡

Introduction

根据最新报告，2020年全球有1930万患者被诊断出癌症，1000万人死于癌症。迄今为止，子宫内膜癌(Endometrial carcinoma, EC)是最常见的上皮性恶性肿瘤。传统的癌症治疗方法（包括手术切除、化疗和放疗）对正常细胞有不同程度的损伤。到20世纪60年代，研究者开发出了金属有机抗癌药物，其中顺铂在临床应用中取得了良好的效果。然而，据报道，这些药物具有严重的肾毒性和耐药性。因此，寻找具有靶向性、毒性小、副作用小的替代药物引起了研究者的广泛关注。

在各种肿瘤治疗策略中，细胞程序性死亡被认为是肿瘤治疗的主要方法之一。近年来报道了许多新的非凋亡细胞程序性死亡形式（包括铁死亡和自噬），揭示了细胞凋亡之外的分子机制。自噬在细胞死亡中起着关键作用，被认为是一种与ATGs、Beclin-1、mTOR和p53的修饰有关的自我降解机制。铁死亡是一种基于ROS介导的脂质过氧化引起的非凋亡细胞程序性死亡，受ROS生成、GPX4催化的谷胱甘肽(GSH)与ROS反应以及脂质过氧化的调节。因此，铁水平调节、铁储备和铁转运等因素可能影响铁死亡的发生。GPX4催化的谷胱甘肽中和多余ROS是铁死亡的主要调控过程。根据上述资料，天然化合物诱导自噬和铁死亡是癌症治疗的一个新的研究领域。

在天然化合物中，类黄酮是重要的次生代谢产物，存在于大多数水果和蔬菜中。芹菜素因其具有广泛的抗氧化、抗炎活性而引起食品工业的广泛关注。有研究报道了芹菜素阻滞细胞周期、对抗氧化应激、诱导凋亡和免疫刺激作用。近年来，芹菜素与JAK/STAT和NF-κB有关的抗癌作用已被证实。

作者探索了芹菜素通过自噬和铁死亡促进Ishikawa细胞死亡的作用，以及相关的分子机制。芹菜素可通过自噬和铁死亡促进Ishikawa细胞死亡，为进一步开发和利用芹菜素作为一种有前景的抗癌药物提供了基础。

Results and Discussion

芹菜素抑制肿瘤生长

芹菜素在体内对肿瘤生长有明显抑制作用。与对照组相比，肿瘤体积减少了50.49%，重量减少了50.63%。芹菜素对小鼠体重无明显影响。H&E染色结果显示，对照组肿瘤组织致密，间质未见新生血管。芹菜素组处理组肿瘤组织质地较为疏松，可见凋亡细胞。肿瘤组织内有少量炎细胞浸润，间质内无新生血管。肿瘤组织坏死面积增大，有中心区坏死，坏死面积大于肿瘤总面积的1/2，坏死区内可见炎细胞浸润。

图1芹菜素对Ishikawa移植瘤生长的抑制作用

芹菜素诱导Ishikawa细胞铁死亡

为了探究芹菜素是否会引起Ishikawa细胞铁死亡，作者加入了铁死亡的抑制剂Fer-1进行集落实验，结果显示，与未处理组相比，芹菜素处理组明显抑制了集落形成率。为了进一步验证芹菜素对Ishikawa细胞铁死亡的影响，作者测定了Ishikawa细胞中铁离子、GSH和MDA的含量。结果表明，芹菜素增加了铁离子，降低了GSH的含量，增加了MDA的含量。这些结果表明，芹菜素能促进Ishikawa细胞铁死亡。

图2 芹菜素对铁死亡的影响

芹菜素诱导Ishikawa细胞自噬

为了研究芹菜素是否能够诱导细胞自噬，作者加入了自噬抑制剂CQ进行集落实验。与单独使用芹菜素组相比，CQ和芹菜素组的集落形成率增加。作者进一步在基因和蛋白质水平验证了芹菜素是否能促进Ishikawa细胞自噬。在体外，mRNA和蛋白的表达趋势相同，均表现为AMPK、mTOR、P70S6K、ATG4表达下调，ULK1、Beclin 1、LC3B、ATG5、ATG13表达上调。加入自噬抑制剂CQ后，芹菜素对石川细胞蛋白的调节作用减弱。与芹菜素组比较，芹菜素和CQ组AMPK、mTOR、P70S6K、ATG4蛋白水平上调，ULK1、Beclin 1、ATG5、LC3B蛋白水平下调。在体内条件下，基因和蛋白质也发生了相同的变化。

图3 芹菜素对自噬的影响

图4 芹菜素对自噬相关mRNA和蛋白的影响

对其他器官的影响

为了探讨芹菜素对小鼠其他器官的毒性作用，作者在小鼠模型上进行了病理分析。芹菜素对心、肝、脾、肺、肾无明显影响。肝脏小叶结构正常，肝细胞无退行性变，无坏死，肝窦无充血。心脏心肌细胞结构正常，界限不清，心肌轻度变形。心脏组织间质未见充血水肿，偶见炎性细胞浸润。肾脏方面，肾小球结构良好，大小正常，小管未肿胀，间质未水肿，无局部充血。肺方面，小鼠肺组织的肺泡壁结构和支气管结构完好，支气管上皮细胞无脱落，腔内无分泌物，肺泡壁无增厚。脾脏包膜结构完整、光滑。

图5 心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H&E染色代表性结果

芹菜素可能引起Ishikawa细胞铁死亡和自噬的机制

图6 芹菜素引起Ishikawa细胞铁死亡和自噬的可能机制示意图

Conclusion

芹菜素可通过上调ULK1、Beclin1、LC3B、ATG5、ATG13等蛋白表达，下调mTOR、P70S6K、ATG4等蛋白表达，促进Ishikawa细胞自噬。此外，芹菜素处理增加了铁离子浓度，降低了GSH含量，增加了MDA含量。芹菜素还能提高Ishikawa细胞中P62、HMOX1、铁蛋白的蛋白表达，降低SLC7A11、GPX4的蛋白表达，诱导Ishikawa细胞铁死亡。在体内，芹菜素通过自噬和铁死亡抑制肿瘤生长，对小鼠的心、肝、脾、肺、肾的正常生理功能和体重均无影响。结果表明，芹菜素是一种低毒高效的抗癌药物。

作者简介

第一作者

梁艳翠，合肥工业大学食品与生物工程学院食品科学与工程2020级硕士研究生。主要研究方向为芹菜素对人子宫内膜癌Ishikawa细胞的抑制作用及其机理。以第一作者身份发表SCI论文2 篇。

通信作者

魏兆军，博士、教授、博士生导师。北方民族大学生物科学与工程学院院长、合肥工业大学教授。主要研究方向为农林特产功能性食品加工。享受国务院政府特殊津贴；教育部食品科学与工程类专业教学指导委员会委员；宁夏回族自治区自治区特聘专家、宁夏回族自治区高等学校特聘教授、教育部新世纪优秀人才、安徽省杰出青年基金获得者、黄山学者特聘教授；中国食品科学技术学会特殊食品分会理事、中国生物化学与分子生物学学会农业分会理事；安徽省农林特产食品加工产业技术创新战略联盟理事长、安徽省养生文化研究会会长、合肥市营养学会理事长、安徽省农产品加工技术协会副会长。国家自然基金、国家留学基金、教育部和多个省基金和科技项目评审专家；国家科技进步奖、教育部和多个省科技进步奖评审专家。Trends in Food Science & Technology、Food Chemistry、Food and Chemical Toxicology等国内外50余期刊审稿人。Agri-Waste & Agri-Byproduct Journal主编；Frontiers in Nutrition副主编、Current Topics in Nutraceutical Research副主编、eFood副主编、Food Frontiers副主编、Food Science and Human Wellness 编委、Journal of Future Foods 编委、Natural Resources for Human Health编委、《食品科学》编委；Food and Chemical Toxicology、Phytomedicine等期刊客座编辑。先后获得国家科学技术进步二等奖1项，省部级科技进步奖5项。主持国家自然科学基金5项，主持省科技重大专项等科研项目30余项。以第一或者通讯作者在Trends in Food Science & Technology、Food Chemistry、Food and Chemical Toxicology发表高水平论文200余篇，获得授权专利20余件。

Apigenin, a natural flavonoid, promotes autophagy and ferroptosis in human endometrial carcinoma Ishikawa cells in vitro and in vivo

Yancui Lianga, Qian Zhonga,b, Runhui Maa,b, Zhijing Nia,b, Kiran Thakura,b, Jianguo Zhanga,b, Zhaojun Weia,b,*

^a School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China

^b School of Biological Science and Engineering, Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety, North Minzu University, Yinchuan 750021, China

*Corresponding author.

Abstract

Apigenin, a natural flavonoid has been reported against a variety of cancer types. However, it is unclear whether apigenin can promote autophagy and ferroptosis in Ishikawa cells. There are few reports on the mechanism of apigenin on autophagy and ferroptosis of endometrial cancer Ishikawa cells. We found that iron accumulation, lipid peroxidation, glutathione consumption, p62, HMOX1, and ferritin were increased, while, solute carrier family 7 member 11 and glutathione peroxidase 4 were decreased. Ferrostatin-1, an iron-death inhibitor could reverse the effects of apigenin in Ishikawa cells. On the other hand, apigenin could promote autophagy via up-regulating Beclin 1, ULK1, ATG5, ATG13, and LC3B and down-regulating AMPK, mTOR, P70S6K, and ATG4. Furthermore, apigenin could inhibit tumor tissue proliferation and restrict tumor growth via ferroptosis in vivo.

Reference:

LIANG Y C, ZHONG Q, MA R H, et al. Apigenin, a natural flavonoid, promotes autophagy and ferroptosis in human endometrial carcinoma Ishikawa cells in vitro and in vivo[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2242-2251. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.044.