绿叶挥发物是一类气态小分子物质，主要由挥发性脂肪酸衍生物中的C6醇类、醛类、酸类等构成，在植物受到如病原体侵害、昆虫取食、机械损伤等胁迫时产生。茶树鲜叶响应非生物胁迫时会散发绿叶挥发物，前人研究也证实，在乌龙茶加工过程中，茶树鲜叶经过萎凋、做青、杀青等加工工序，香气动态变化主要呈现为青草气的逐渐逸失以及清香、花果香的形成与积累。参与此香气转变过程的(Z)-3-己烯醛具有青草气，而(E)-2-己烯醛具有清香、果香，明确参与调控这两种化合物之间转化的基因及其表达水平亦可为解释乌龙茶加工过程中香气转变的原因提供参考。
福建农林大学园艺学院的吴晴阳、周子维和孙云*等以乌龙茶鲜叶、萎凋叶、摇青叶、等时间摊放叶为实验材料，通过对比样品中(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的变化趋势，利用Cupin筛选调控(Z)-3-己烯醛、(E)-2-己烯醛转化关系之间的基因，计算基于转录组数据筛选出CsHI基因的相对表达水平，分析乌龙茶加工过程中(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的转化机制，旨在为探明乌龙茶香气物质的变化规律提供参考，从而为乌龙茶品质形成机理提供借鉴。1 乌龙茶加工过程中(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的鉴定及其动态变化分析
利用顶空固相微萃取法结合气相色谱-飞行时间串联质谱技术，对加工过程中的乌龙茶样品进行香气物质检测，基于NIST数据谱库鉴定(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛组分的离子峰，并依据此两种物质的变化趋势绘制折线图。如图3所示，在乌龙茶加工过程中的做青阶段，(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛大体呈现“此消彼长”的动态变化趋势。值得注意的是，每次摇青工艺的进行都促使(Z)-3-己烯醛呈现上升趋势，并在第3次摇青（H7）处达到峰值。而每次摇青后经过一定时间的摊放处理，例如第1次摇青后至第2次摇青开始前的摊放过程，即H3～H4阶段，以及第2次摇青后至第3次摇青开始前的摊放过程，即H5～H6阶段，(Z)-3-己烯醛则呈现减少趋势。在前期加工过程，(E)-2-己烯醛含量处于较小波动状态。值得注意的是，与(Z)-3-己烯醛变化趋势相反，(E)-2-己烯醛在萎凋以及第1、2、3次摇青后的摊放过程，都呈现逐渐上升的趋势，并在第3次摇青前（H6）达到峰值。在茶树鲜叶离体至萎凋阶段（H1～H2）以及在第1次摇青结束至第2次摇青开始前的摊放阶段（H3～H4），(E)-2-己烯醛较小幅度增加；而在加工中后期即第2次摇青结束至第3次摇青开始前的摊放阶段（H5～H6），(E)-2-己烯醛呈明显增加趋势；在第3次摇青结束后（H7），(E)-2-己烯醛又迅速下降。对比(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛在鲜叶（H1）和各加工过程节点中的组内差异性，发现(E)-2-己烯醛仅在H4和H6处存在极显著差异（P＜0.01）；而(Z)-3-己烯醛则在H2～H6处存在极显著差异（P＜0.01），在H7处存在显著差异（P＜0.05）。总体来看，(Z)-3-己烯醛在做青期间变化幅度较(E)-2-己烯醛明显，并且两种物质之间的增减变化呈现一定程度的相反趋势和互补趋势。 
通过Me_V软件作图后对比筛选出的44 个转录本的每千个碱基的转录每百万映射读取的片段（FPKM）热图，结果如图4所示。依据热图的聚类，可将44 条基因划分为3 个大类。第1大类具体包含CL711.Contig9_All、Unigene15913_All等14 条基因在内的较低表达的基因，此大类的基因在鲜叶乃至加工过程中表现出低表达状态。第2大类包含CL5954.Contig6_All、CL7529.Contig2_All在内的18 条基因，此大类包含的基因表达水平较高；值得注意的是，此类基因在不同处理过程中普遍有较高表达，并且如Unigene19480_All等基因在经过摇青处理（H7）后表达量较鲜叶（H1）和萎凋（H2）处理上调，在经过长时间的摊放（CK7）后也有较高的表达；基因Unigene33696_All则在鲜叶（H1）和萎凋（H2）处理中含有较高表达量，但经过摇青（H7）处理和长时间摊放（CK7）后表达量下降。第3大类包含Unigene43037_All、Unigene1394_All在内的12 条基因，此大类基因多处于中表达水平，个别基因在经过摇青处理后表达量上调，如CL1621.Contig3_All、Unigene23067_All等，亦有基因如Unigene43037_All、Unigene1394_All等呈现表达量下降。
考虑FPKM大于10的转录本，并且结合对比差异倍数，筛选出CL7529.Contig2_All、Unigene19480_All、Unigene1576_All和Unigene33696_All 4 条候选基因进行后续研究将其分别命名为CsHI1、CsHI2、CsHI3和CsHI4。
CsHI基因已被证实具有异构作用，其在乌龙茶加工过程中的表达水平还有待验证。因此，结合转录组数据，根据real-time PCR结果中4 条候选基因表达量水平衡量在加工各个阶段CsHI基因的表达量，结果如图5所示。在实验组中，CsHI1在萎凋（H2）处有最高表达量（19.36），但随着做青工艺的进行，表达量呈现下降趋势，在做青后期略微上升。在对照组中，表达量呈现波动上升的趋势，在H6处达到最大值（1.97），并且是对照CK6（1.16）的1.7 倍。结合差异性分析显示，H3～H7实验组与对照组间存在极显著差异（P＜0.01），同时也存在极显著组间差异（P＜0.01）。
与CsHI1类似，CsHI2在H2处也具有较高的表达量（52.62），但其表达量在H4处达到峰值（321.92），并在随后处理中显著下降。在对照组中，仅在CK6处测得较高的表达水平（13.27），是实验组H6（7.33）处表达量的1.8 倍。结合差异性分析显示，除H3与CK3存在显著差异（P＜0.05）外，H4～H7与相应的对照组之间存在极显著差异。 与前两个基因的变化趋势稍有不同，CsHI3呈现随着加工的推进而表达量波动上升的总体趋势，值得注意的是，在第1次摇青开始的H3处以及第2次摇青开始的H5处，CsHI3的表达量显著下降（0.41，0.28），而在摇青结束后的H4和H6处，CsHI3的表达量却显著提升（1.97，2.83），并在H6处达到最高值，并且相对应的CK6同样拥有对照组中的最高表达量（1.34）。除H6与CK6之间存在显著差异（P＜0.05）外，其余处理之间均存在极显著差异（P＜0.01）；并且H6与其他处理均存在极显著的组间差异（P＜0.01）。 对比前3 个基因的在实验组做青环节中的表达模式，CsHI4则在对照组中拥有更高的表达，值得注意的是，伴随着茶树鲜叶离体，并经历了一定时间的摊放，CsHI4的表达量逐渐上升并在CK4处达到最高值（3.10），随后呈现下降趋势。而实验组中的表达量则在摇青后期H6处呈现较高水平（0.43）。H3与CK3、H5与CK5、H6与CK6、H7与CK7存在极显著差异（P＜0.01），仅在H4与CK4处存在显著差异（P＜0.05），并且H4与其他处理存在组间极显著差异（P＜0.01）。 结合热图中4 条CsHI基因在不同处理中的表达水平，发现4 条基因的表达水平及变化趋势与转录组表达水平基本吻合，因此进行下一步研究。
4 乌龙茶加工过程中(Z)-3-己烯醛与(E)-2-己烯醛和CsHI基因相对表达水平关联性分析
利用Pearson相关系数评估乌龙茶加工过程中，所筛选的4 条茶树CsHI基因的表达水平与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的相关性，结果如表2～5所示。将实验组与对照组的处理划分进行相关性分析，具体是划分为实验组中H1～H3，即茶树鲜叶到第1次摇青结束处理为一组，H4～H5即第2次摇青前及摇青结束的处理为一组，H6～H7即第3次摇青前及摇青结束的处理为一组；对照组中以CK3～CK5为一组，即第1次摇青结束至第2次摇青结束的等时摊放对照为一组，CK6～CK7即第3次摇青开始及摇青结束的等时摊放对照为一组。
在CsHI1基因表达量与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的关联性分析中，实验组H1～H3处理中，CsHI1基因表达量与(Z)-3-己烯醛存在负相关，并与(E)-2-己烯醛显著相关，可以推测此时的乌龙前期茶萎凋及摇青带来的失水、机械胁迫促使CsHI1表达，(Z)-3-己烯醛下降，进而形成(E)-2-己烯醛。然而，在H4～H5处理中，CsHI1与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛之间分别存在极显著相关，在H6～H7处理中，则存在负相关，推测此时乌龙茶加工已经进行至中后期，(Z)-3-己烯醛并未完全消散，(E)-2-己烯醛也在茶叶中拥有一定含量，结合CsHI1基因的表达水平，推测CsHI1对后期连续的机械胁迫响应较弱。在对照组中，CsHI1基因只在CK6～CK7处理与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛存在极显著相关性，亦有助于支撑CsHI1基因对较长时间失水胁迫具有较好的响应。
在CsHI2基因表达量与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的关联性分析中同样发现，此基因在H1～H3处理下与(Z)-3-己烯醛之间存在负相关，然而却与(E)-2-己烯醛无显著相关性，并在乌龙茶加工中后期H4～H5、H6～H7阶段与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛都存在极显著相关性。联系实际生产过程，较为短暂的摇青过程促使大量具有青草气、清香的物质以挥发物形态快速逸失，而摇青后摊放也以较缓慢的过程生成乌龙茶的风味物质，其中也包括(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛。在对照组中，CsHI2基因同样在CK6～CK7处理中与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛存在极显著相关性。因此推测CsHI2基因在经过前期较长时间萎凋后，由于第1次摇青的机械胁迫，诱导(Z)-3-己烯醛转变为(E)-2-己烯醛；结合此基因的表达水平，发现在后续的加工过程中，此基因对摇青后的摊放处理具有较高的响应，推测其同样对摇青后的失水胁迫具有较好的响应。
与CsHI2基因类似，在CsHI3基因表达量与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的关联性分析中，此基因在H1～H3处理下仅与(Z)-3-己烯醛存在负相关，然而并未得到其与(E)-2-己烯醛存在相关性，在H4～H5、H6～H7、CK6～CK7等处理下同样存在极显著的相关性。然而结合CsHI3基因在乌龙茶加工过程中的表达水平，发现其呈现随着加工工艺的推进，实验组中基因表达量呈现波动上升的趋势，具体在摇青后的摊放过程有上调的表达量，推测经过摇青快速且加猛烈的机械胁迫后，缓慢失水更有助于此基因的表达，且机械胁迫对此基因的表达具有一定的抑制作用。
与前3 条基因不同，在CsHI4基因表达量与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的关联性分析中，实验组中此基因与(E)-2-己烯醛存在负相关，并且在H4～H5处理中与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛存在极显著负相关，在H6～H7处理中则与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛存在极显著正相关。在对照组中，CsHI4基因在CK3～CK5处与(E)-2-己烯醛负相关，在CK6～CK7与(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛有极显著相关性。结合CsHI4基因在不同处理中的表达水平，发现在前期乌龙茶加工过程中，实验组摇青带来的胁迫对此基因的表达具有抑制作用；相反，在对照组中，与萎凋、摊放等工艺有关的失水胁迫则促使CsHI4基因表达量上调。这或许可以解释不同处理下，CsHI4基因和(E)-2-己烯醛存在较大比例的负相关的关系，原因是前期加工带来的机械损伤未能有效促使(Z)-3-己烯醛向(E)-2-己烯醛转化，反而是长时间的摊放失水明显诱导CsHI4基因的表达。 
为了解CsHI基因家族成员和其他物种相关基因之间亲缘关系和进化距离，在NCBI上对获得的4 个茶树HI基因的核酸序列进行在BLAST，并利用MEGA7.0结合在线工具iTOL（http://itol.embl.de/upload.cgi）构建转录组中筛选获得的包括Unigen... 个物种的17 个与茶树CsHI基因核酸序列相似的核酸序列，构建的系统发育进化树划分为4 个大类，标记为a～d。其中，a大类成员包括Unigene33696_All，茶树中与生长素结合蛋白、类萌发素蛋白相关的两条基因与其密切相关，同样具有较近亲缘关系的基因也包括胡萝卜、向日葵、百日菊、白桑、川桑等物种在内的生长素结合蛋白、类萌发素蛋白等相关基因。b大类成员包含Unigene19480_All，除与茶树中球蛋白贮藏蛋白相关的基因具有较高同源性之外，此基因与葡萄中相关功能的蛋白也具有较近的亲缘关系。c大类成员包含Unigene1576_All，与Unigene33696_All类似，具有与番木瓜、一串红、麻风树、茶树等物种中的类萌发素蛋白相关的基因具有较近亲缘关系。CL7529.Coting2_All归属于d大类，其与咖啡、一串红、二粒小麦、水稻中类萌发素蛋白相关的基因具较高相似度，同样也具有与茶树类萌发素蛋白相关的基因聚在同一分支。结合进化树HI基因家族成员普遍与类萌发素蛋白相关的基因具有较近的同源性，推测HI基因可能具有相关的生物学功能。 
(Z)-3-己烯醛与(E)-2-己烯醛都是重要的绿叶挥发物。在HI的作用下，(Z)-3-己烯醛可异构为(E)-2-己烯醛。在有关HI的研究中发现，HI具有Cupin蛋白结构域。Cupin来源于拉丁语“Cupa”，意思是指至少由6 个β-折叠片形成的桶状结构。具有2 个Cupin结构域的蛋白最早于高等植物种子贮藏蛋白中发现。在本研究构建的进化树中发现，茶树中球蛋白贮藏蛋白基因与HI聚集在同一分支，此蛋白具有保守的Cupin结构域，是Cupin蛋白超家族的一员。同样，在进化树中显现出的许多与HI较近亲缘关系的其他物种中的类萌发素蛋白，同样含有β-折叠桶状结构域，二者均属于Cupin蛋白家族。由于大多数Cupin蛋白家族成员都具有致敏性，且致敏蛋白涵盖来自坚果、花生、大豆、芝麻等物种，因此不仅在植物的抗性研究方面，在食品、医药的研究中Cupin蛋白的研究也十分受人关注。
乌龙茶加工过程中(Z)-3-己烯醛与(E)-2-己烯醛的转化和关键基因的表达
早期有关茶树(Z)-3-己烯醛及其衍生物的研究，多聚焦在(Z)-3-己烯醛和(Z)-3-己烯醇。研究发现，在绿茶的春茶中，(Z)-3-己烯醇是代表香气成分之一，并且(Z)-3-己烯醇是构成绿茶栗香与清香的赋香物质；乌龙茶的做青工艺也有助于(Z)-3-己烯醇形成与积累，相关CsADH基因也对做青过程的机械损伤与失水双重胁迫具有良好响应。 本研究以加工过程中的乌龙茶为实验样品，检测不同加工环节(Z)-3-己烯醛和(E)-2-己烯醛的含量，筛选调控(Z)-3-己烯醛向(E)-2-己烯醛转化的关键基因及其表达水平鉴定。结果发现，(Z)-3-己烯醛向(E)-2-己烯醛转化主要发生在乌龙茶摇青后的摊放阶段，叶片反复经过摇青机械力的损伤，细胞破碎率增加，促使CsHI基因响应表达；摇青后的静置摊放，给予(Z)-3-己烯醛逐渐向(E)-2-己烯醛转化的充足时间。这或许可以解释，在实际生产中，将呈现萎软状态的叶片进行做青，促使茶叶“走水还阳”，即由于主脉中水分向叶片输送，使叶片恢复一定的挺直状态，在此期间，反复的做青促使茶叶香气逐渐由青草气向清香、花果香转变，从而影响乌龙茶品质形成。而(Z)-3-己烯醛与(E)-2-己烯醛分别是构成茶叶青草气、清香或花果香的重要物质。因此，该结果将为筛选乌龙茶特征香气物质与机理研究提供参考，也将为乌龙茶的加工技术提升与品质调控提供借鉴。 本文《乌龙茶加工过程中(Z)-3-己烯醛与(E)-2-己烯醛转化关键调控基因的筛选与表达分析》来源于《食品科学》2023年44卷第16期205-212页，作者：吴晴阳，周子维，杨云，胡清财，黄慧清，林佳琪，吴宗杰，赖钟雄，孙云*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220826-322。
