糖尿病是一种代谢综合症，2021年全世界的患病人数达5.37亿人。大多数糖尿病患者属于2型糖尿病（T2DM），主要是由不同程度的胰岛素缺乏和胰岛素抵抗所致。血液中胰高血糖素样肽-1（glucagon -like peptide-1, GLP-1）由小肠分泌，它的活性形式在胰细胞葡萄糖依赖性胰岛素的生物合成和分泌中发挥着重要作用，但是活性胰高血糖素样肽-1会被二肽基肽酶-IV（DPP-IV）快速降解而失去活性，从而抑制胰岛素的分泌，致使血糖升高。食物源的DPP-IV抑制肽具有良好的降血糖效果，可以作为治疗高血糖化学合成药物的潜在替代品。已报道的海洋蛋白质如大口黑鲈、海藻、鲑鱼、沙丁鱼等是产生各种DPP-Ⅳ抑制肽的良好来源。然而，目前多数发现的DPP-Ⅳ抑制肽通常是通过使用市售蛋白酶水解蛋白质制备的，由于其水解位点的限制，导致产生的DPP-Ⅳ抑制肽的多样性较低，从而限制了具有高生物活性的新型DPP-Ⅳ抑制肽的发现。

发酵食品是生物活性肽的良好来源。发酵食品中复杂的微生物群落可产生多种多样的蛋白酶，为发现新型高生物活性DPP-Ⅳ抑制肽提供了可能。然而，目前对发酵食品特别是水产发酵食品中DPP-Ⅳ抑制肽的研究较少。臭鳜鱼是一种以鳜鱼为原料制作的传统水产发酵食品。臭鳜鱼中的微生物菌群结构复杂，且能够分泌多种多样的蛋白酶，因此会产生更多结构多样的活性肽。而且，鳜鱼蛋白中富含脯氨酸，为高活性DPP-IV抑制肽的筛选提供了可能。

中国水产科学研究院南海水产研究所杨大俏博士、李春生副研究员*、李来好研究员*等采用宏基因组学、多肽组学及虚拟筛选技术，解析了臭鳜鱼发酵过程微生物菌群与DPP-Ⅳ抑制肽的变化规律，借助模拟酶切与相关性网路图，揭示了微生物代谢导致的臭鳜鱼中DPP-Ⅳ抑制肽的形成机制。利用分子对接技术研究了臭鳜鱼中DPP-Ⅳ抑制肽与DPP-Ⅳ的能量相互作用，进而阐明了DPP-Ⅳ抑制肽的作用机制。

DPP-IV抑制活性实验表明，臭鳜鱼的多肽提取物具有较高的DPP-IV抑制活性，且发酵后活性明显增加。利用多肽组学技术在臭鳜鱼多肽提取物中共鉴定出8 252 种游离多肽，通过活性网站BIOPEP-UWM搜索具有DPP-IV抑制活性的氨基酸残基片段，不同发酵时间臭鳜鱼多肽中共有278 种具有DPP-IV抑制活性的氨基酸残基，其中KA (2120)、VK (2043)、AE (2025)、KK (1990)、KE (1974)、EK (1957)、EV (1448)、KV (1433)、VE (1424)、PA (1285)、VD (1283)、AD (1270)、KP (1258)、TV (1251)、ET (1221)、AA (1213)、EP (1157)、AP (1111)、AL (1067)和KT (1021)是多肽中出现最多的氨基酸残基序列（图1）。从这些多肽中筛选出疏水性最高（≥22.24 kcal/mol）的前400条肽（P1-P400）作为DPP-IV抑制肽，作者发现大多数DPP-IV抑制肽的丰度在发酵后显著增加。

臭鳜鱼发酵过程中微生物菌群变化

臭鳜鱼中共鉴定出Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Fusobacteria、Actinobacteria、Uroviricota等6 个细菌门，其中Firmicutes和Proteobacteria为优势菌门，在整个发酵过程中总相对丰度均超过84%。在不同发酵时间下相对丰度≥0.1%的菌属共69 个，随着发酵时间的延长，Escherichia、Bacillus、Kocuria和Pseudomonas的相对丰度显著降低，而Vagococcus、Psychrobacter、Enterococcus和Peptostreptococcus的相对丰度有所提高。

臭鳜鱼中关键微生物属与DPP-IV抑制肽的相关性网络

基于Pearson相关性数据构建了35个丰度最高的微生物菌属与50个丰度最高的DPP-IV抑制肽的相关性网络（图2）。结果显示，共发现了三个微生物聚类，有21个菌属与30多个DPP-IV抑制肽显著相关。Lactococcus、Bacillus、Lysobacter、Pelagivirga、Kocuria和Escherichia与最多的DPP-IV抑制肽相关（48条），其次是Streptococcus和Peptostreptococcus（47条）。其中P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10分别与21、21、6、22、22、18、21、21、22和19个微生物菌属显著相关。这几条DPP-IV抑制肽均为无毒、水溶性好、具有酸性等电点的新型多肽，其中KAGARALTDAETAT（P1）、GEKVDFDDIQK（P2）、VVDADEMYLKGK（P4）和GQKDSYVGDEAQ（P6）稳定且无致敏性，具有潜在的应用价值。

臭鳜鱼中DPP-IV抑制肽的形成和抑制机制

经模拟酶切及相关性网络分析，DPP-IV抑制肽P1、P2、P4和P6主要由Bacillus、Kocuria、Lysobacter、Lactococcus和Peptostreptococcus产生的枯草杆菌蛋白酶（EC 3.4.21.62）、天冬氨酸蛋白酶（EC 3.4.23.1）、嗜热菌蛋白酶（EC 3.4.24.27）、寡肽酶B （EC 3.4.21.83）和蛋白酶P1（EC 3.4.21.96）酶切形成（图3A）。分子对接结果显示，DPP-IV抑制肽P1、P2、P4和P6主要与DPP-IV酶中的Arg、Tyr残基形成盐桥，与Arg、Asp、Tyr形成常规氢键，与Ser形成碳氢键，最终使该酶失活（图3B）。

图3 臭鳜鱼中关键DPP-IV抑制肽的形成和抑制机制

臭鳜鱼多肽中共含有278种具有DPP-IV抑制活性的氨基酸残基，大多数DPP-IV抑制肽的丰度在发酵后有所提高，与臭鳜鱼多肽提取物的活性实验结果一致。DPP-IV抑制肽KAGARALTDAETAT、GEKVDFDDIQK、VVDADEMYLKGK和GQKDSYVGDEAQ结构中含有众多活性氨基酸残基，且本身无毒、水溶性好、稳定、无致敏性，具有潜在的应用价值。这4种DPP-IV抑制肽主要由Bacillus、Kocuria、Lysobacter、Lactococcus和Peptostreptococcus产生的枯草杆菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、寡肽酶B和蛋白酶P1酶切形成。DPP-IV抑制肽结构中的活性基团通过与DPP-IV酶中特定的氨基酸残基形成盐桥、常规氢键和碳氢键来发挥抑制作用。本文研究为今后以鳜鱼为原料定向制备特定的高活性DPP-Ⅳ抑制肽提供重要的蛋白酶及其微生物来源信息。