谷子（Setaria italica L.）富含蛋白质、脂肪、膳食纤维和多酚，不含麸质，营养均衡，且有益于人体健康。谷子曾是北方的主粮之一；然而，随着小麦和水稻的推广，谷子面临耕地面积减少、产量低、口感差的问题，逐渐转变为粗粮。近年来，对张杂谷等高产、抗逆性强和适口性佳的谷子的研究日益增多,促进了谷子的推广。目前，主食的主要形式是面条和馒头，它们大多由小麦制成，然而其高麸质和高糖特性对麸质不耐受和高血糖人群不友好,而谷子在预防乳糜泻、控制血糖、降低癌症风险方面具有明显优势。市售馒头多用酵母发酵，这种传统的发酵剂效率高且稳定性强，然而酵母发酵产品可能味道单一且营养缺乏。因此，寻找合适的酵母替代品仍是一个关键问题。

老面在世界范围内被广泛用于制作面包和馒头，因产品风味醇厚、口感柔和、保质期长而受到消费者喜爱。微生物是保证老面发酵馒头质量的核心，例如，乳酸菌（LAB）负责酸化和风味形成，而酵母菌主要参与发酵产气。将老面加入面粉中发酵面团，微生物演替直至菌群稳定，菌群的动态变化可能与多种因素有关，包括面粉类型、环境条件和工艺参数（如温度、面团产量、发酵时间）。近年来，老面在微生物结构、代谢活动、风味形成和质地特性方面受到了广泛关注，已有研究通过高通量测序报道Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis、Pediococcus pentosaceus、Lactobacillus paralimentarius和Lactobacillus fermentum是老面中常见的LAB菌种。然而，对馒头制作过程中面团中微生物演替的研究较少，特别是对以谷子为原料的馒头微生物多样性研究更少。

宏基因组学是探索食品发酵过程中微生物多样性的新兴技术。细菌全基因组的宏基因组为分析在其在群落和生态系统中的“分类群特异性”潜力提供了一条途径，以便深入了解微生物的生态适应性、营养相互作用和代谢多样性。本研究通过宏基因组分析确定老面发酵小米面团前后的细菌群落结构和潜在功能，该结果有助于深入了解面团发酵过程，并有助于鉴别可能与风味代谢物生产相关的特定有益细菌。

微生物群落组成

宏基因组测定老面小米面团发酵前后的细菌群落结构组成如图1所示。厚壁菌门和变形菌门是丰度最高的门，随着发酵进行，厚壁菌门增多而变形菌门减少，可能是由于发酵后期产生高水平的酸抑制其生长。面团中排名前5的菌属均属于乳酸菌，分别为Companilactobacillus、Limosilactobacillus、Pediococcus、Lactobacillus和Lactiplantibacillus，与酸化和风味生产密切相关。Companilactobacillus和Limosilactobacillus分别是SDF0和SDF2的优势属。Limosilactobacillus及Limosilactobacillus_fermentum是唯一在发酵后丰度升高的菌属/菌种，这可能与其较高的耐酸能力和代谢适应力有关。结果表明，面团中的LAB主要由专性和兼性异型发酵乳酸菌组成，具有较高的糖代谢和风味代谢潜力，其组成多样性取决于多种因素，包括原料、环境、代谢活动和技术参数。Companilactobacillus_crustorum在发酵前后均为优势菌种，是平原地区老面中常见的优势菌种，而Lactiplantibacillus_plantarum所占比例较低，可能与实验室环境有关。

图1 面团发酵过程中（a）门、（b）属和（c）种水平的细菌群落组成

宏基因组测序预测的代谢通路

为了深入了解功能通路和预测基因之间的关联，采用COG、CAZy和KEGG数据库进行基因注释。共有6 081个基因映射到eggNOG数据库，代谢途径占主导地位，其次是信息存储和处理以及细胞过程和信号传导（图2a）。发酵后氨基酸、辅酶、核苷酸和脂质转运和代谢的相对丰度显著上升，可能促进蛋白质水解和微生物代谢产物的合成。CAZy数据库注释结果显示，基因主要富集在糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）和碳水化合物酯酶（CEs）并且在发酵后显著增加，而较少富集在辅助性活性酶（AAs）、碳水化合物结合模块酶（CBMs）和多糖裂解酶（PLs）。

图2 微生物群落内代谢途径的预测基因。（a） COG数据库注释基因的相对丰度；（b）碳水化合物代谢和氨基酸代谢相关基因的相对丰度；（c）两组间糖酵解和氨基酸生物合成途径相关酶的读数。

此外，将4 762 个基因与KEGG通路进行比对，代谢途径的基因注释数量最多，且发酵后相对丰度显著增加，而其他途径相对丰度均减少（图3a）。2级通路中，全局与概述图谱、碳水化合物代谢和氨基酸代谢途径最为丰富，表明碳水化合物和氨基酸是面团发酵过程中微生物代谢的主要底物（图3b）。此外，对这3条通路进行3级通路注释，基因数量在发酵后均在发酵后增加，呈现出1.67~5.44倍的变化（图3c）。糖酵解/糖异生（ko00010）、淀粉和蔗糖代谢（ko00500）、氨基糖和核苷酸糖代谢（ko00520）和丙酮酸代谢（ko00620）在碳水化合物代谢中含量最高。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（ko00250）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（ko00260）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢（ko00270）和赖氨酸生物合成（ko00300）在氨基酸代谢途径中富集。丙酮酸是一种重要的中间体，可转化为多种代谢物，如乙酸盐、乳酸盐、乙醇、亮氨酸和丙氨酸。丙酮酸代谢和氨基酸合成相关通路的相对丰度增加，表明微生物代谢产物生产活性增强。

图3 微生物群落注释到KEGG通路的基因多样性。（a）1级通路相关基因相对丰度；（b）2级通路功能基因数目；（c）3级通路基因数目。

与糖代谢和氨基酸合成相关的酶

在面团发酵过程中，微生物对底物的转化有助于促进酸化和风味形成，因此，研究与底物（尤其是碳水化合物和氨基酸）代谢相关的酶具有重要意义。参与糖酵解和氨基酸生物合成的酶如图2c所示。糖酵解是面团发酵酸化所必须的途径，与SFD0相比，SFD2中与酸化过程相关的所有酶均显著上升（P < 0.001），丙酮酸脱羧酶（EC 1.2.4.1）、乙醇脱氢酶（EC 1.1.1.1）、l -乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27）是样本中丰度较高的酶。此外，还检测到大量与葡萄糖生成相关的酶，表明发酵过程中微生物促进碳水化合物代谢。

多种酶特异性地催化氨基酸生物合成途径的代谢过程。半胱氨酸-S-共轭β-裂解酶（EC 4.4.1.13）、谷氨酸-半胱氨酸连接酶（EC 6.3.2.2）和氨肽酶N（EC 3.4.11.2）在SFD2中丰度最高，与半胱氨酸合成相关，有助于改善面团的弹性、流变特性和面筋结构的稳定性。此外，l -丝氨酸解氨酶（EC 4.3.3.17）、支链氨基酸转氨酶（EC 2.6.1.42）和乙酰乳酸合成酶（EC 2.2.1.6）等酶均有不同程度升高，与磷酸烯醇丙酮酸转化为氨基酸（丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）密切相关。

面团细菌基因组的潜在功能

对KEGG进行通路和酶的分布分析，如图4a所示，Limosilactobacillus、Companilactobacillus、Lactobacillus、Pediococcus和Lactiplantibacillus是与面团代谢密切相关的前5个属。

Lactococcus在发酵过程中仅在淀粉和蔗糖代谢（ko00500）中出现，参与淀粉降解为葡萄糖并将其作为主要碳源，促进风味和滋味物质形成。Secundilactobacillus与精氨酸代谢具有良好相关性，在精氨酸生物合成（ko00220）、精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330）和精氨酸酶（EC 3.5.3.1）中有较高贡献。如图4b所示，糖酵解相关酶广泛富集于Companilactobacillus（如EC 2.7.1.11、2.7.1.199、3.2.1.86、4.1.2.13），氨基酸生物合成酶富集于Limosilactobacillus（如EC 1.1.1.3、2.7.1.39、4.2.3.1、6.3.2.2）。丙酮酸代谢相关酶（如EC 1.1.1.1、1.1.1.27和1.2.1.10）主要富集在Limosilactobacillus和Lactobacillus中，分别催化丙酮酸转化为乙醇、乳酸和乙酸盐，这进一步表明了丙酮酸作为代谢物生物合成中间体的重要性。

图4 （a） KEGG 3级途径和（b）糖酵解和氨基酸代谢途径相关酶在微生物群落中的分布

碳水化合物和氨基酸代谢网络构建

基于宏基因组数据，构建糖酵解和氨基酸生物合成途径网络如图5所示。编码碳水化合物利用酶的基因主要富集在Companilactobaillus，其次是Limosilactobacillus和Lactobacillus。在面团发酵过程中，麦芽糖、蔗糖和葡萄糖是大多数细菌的主要碳源和能量来源，并转化为多种碳水化合物中间体（如α-D-葡萄糖-1P、β-D-葡萄糖- 6P、β-D-果糖-6P），并通过后续糖酵解和丙酮酸代谢途径进一步被利用，产生酸类和氨基酸代谢底物。异型发酵乳杆菌如Companilactobaillus和Limosilactobacillus利用麦芽糖作为首选碳源，从而生成乳酸、乙醇和CO_2，因此它们可能是利用葡萄糖进行糖酵解生成丙酮酸的重要属。

丙酮酸代谢是代谢途径之间底物转换的基础。老面中含有丰富的有机酸，有助于面团酸化和风味合成，其中乳酸为主要产物。Limosilactobacillus、Companilactobaillus和Lactobacillus可能有利于通过l -乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27）将丙酮酸转化为乳酸。此外，丙酮酸也可通过乙酰辅酶A、乙酸盐、乙醛的产物生成途径转化为乙醇，这是面团中另一种含量较高的代谢物。乙醇脱氢酶（EC 1.1.1.1）基因主要由Limosilactobacillus和Lactobacillus编码。

丙酮酸是氨基酸生物合成必需的前体物质。丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和半胱氨酸直接由丙酮酸生成，其他氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸和精氨酸）随后形成，其中脯氨酸和精氨酸可以通过尿素循环产生。Limosilactobacillus和Companilactobaillus分别通过乙酰乳酸合成酶（EC 2.2.1.6）和支链氨基酸转氨酶（EC 2.6.1.42）产生亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸，它们被降解为醛类和醇类，如壬醛、戊醇和辛醇。面团发酵显著增加苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，这些芳香族氨基酸可转化为苯甲醛、苯乙醇和苯乙酸等代谢物。此外，苯丙氨酸和酪氨酸经由组氨酸-磷酸转氨酶（EC 2.6.1.9）转化为抗真菌化合物，该酶由Limosilactobacillus和Lactiplantibacillus编码。综上，氨基肽酶和转氨酶与氨基酸生物合成密切相关，从而生成各类风味物质。

图5 碳水化合物和氨基酸代谢途径网络构建（虚线和实线分别代表多步反应和一步反应）

本研究探索了老面小米面团发酵前后的细菌群落多样性及其潜在功能。在发酵过程中，Companilactobacillus_crustorum是面团中的优势菌种，Limosilactobacillus_fermentum丰度显著增加，这可能与其良好的环境适应力有关。此外，大量注释到代谢的基因表明了面团细菌群落的潜在功能，参与碳水化合物和氨基酸的代谢主要是Limosilactobacillus和Companilactobacillus，其次是Lactobacillus，有助于促进面团酸化和风味化合物的生成。这些结果为开发适合馒头生产的发酵剂提供了理论依据。

第一作者简介

刘俊利，女，本硕毕业于哈尔滨工业大学，现为河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所研究实习员，主要研究方向为发酵食品加工理论研究与产品开发；微生物菌群形成及代谢机制解析。发表SCI及核心论文5篇，主持河北省横向课题1项。

通信作者简介

刘敬科，男，博士，研究员，美国田纳西大学访问学者，现任河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所副所长、国家现代农业产业技术体系岗位科学家、中国作物学会粟类作物专业委员会副秘书长、河北省食品学会副秘书长、河北欧美同学会青委会委员、第三届河北省食品安全专家委员会委员和Journal of Future Foods编委，荣获河北省“省直青年岗位能手”、河北省“三三三”人才称号。主要从事谷物加工基础理论、新产品开发、新技术应用等的研究；主持“十三五”、“十四五”国家现代农业产业技术体系项目、“十四五”国家重点研发计划课题、国家自然基金面上项目、河北省科技支撑项目、河北省自然基金等项目10余项；发表论文67篇，其中SCI/EI论文20篇，授权国家发明专利12项，鉴定成果6项，参与起草国家粮油行业标准3项。

Dynamics and functionalities of bacterial community during foxtail millet dough fermentation by metagenomic analysis

Junli Liu, Wei Zhao, Aixia Zhang, Pengliang Li, Jingke Liu*

Institute of Biotechnology and Food Science, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050000, China

*Corresponding author.

Abstract

Sourdough flavors were closely related to microbial metabolism. The microbial diversity of foxtail millet dough during fermentation has never been studied. Here, the metabolic potential and diversity of the bacterial community were analyzed by metagenomic during dough fermentation. Firmicutes was the dominant phylum in the dough, within heterofermentative lactic acid bacteria (e.g.,Companilactobacillus, Limosilactobacillus, PediococcusandLactobacillus) as the most abundant bacteria. Proteobacteria was gradually inhibited after fermentation.Companilactobacillus_crustorumwas notably found abundant during dough leavening. Limosilactobacillus_fermentumincreased markedly during fermentation, whileCompanilactobacillus_crustorumdecreased significantly. For further exploration, genes associated with metabolism were annotated through metagenomics. Limosilactobacillus, Companilactobacillus andPediococcuswere actively engaged in glycolysis (ko00010), starch and sucrose metabolism (ko00500), and pyruvate metabolism (ko00620), leading in part to lactic and acetic acid accumulations and dough acidification. Limosilactobacillus andLactiplantibacillus were the main contributors to key aminopeptidases or/and transaminases involved in amino acid metabolism, which was responsible for flavor metabolite formation. This study will provide an enhanced understanding of the predominance and diversity of dough bacterial communities, and contribute to future strain screening in the dough for better flavor.

Reference:

LIU J L, ZHAO W, ZHANG A X, et al. Dynamics and functionalities of bacterial community during foxtail millet dough fermentation by metagenomic analysis[J]. Journal of Future Foods, 2024, 4(4): 343-352. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.11.006.