转基因产品低水平混杂（LLP），即生产、贸易及加工的农产品中，因各种原因导致含有较低或极低水平未经进口国批准的转基因成分。在农产品供应链的多个节点上，转基因产品都可能混杂的可能性，因此转基因作物LLP从客观上无法避免。建立科学的转基因大豆LLP判定方法，尤其是定量分析方法，将农产品贸易中的转基因健康及环境风险降到最低，可以保障我国农产品进出口的稳定与进一步的发展。

1 real-time PCR检测模板添加量和定性检测限

将含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%转基因大豆GTS-4-3-2的样品基因组DNA模板10、100 ng及1000 ng加入real-time PCR扩增体系中扩增时，每个扩增反应中添加的内参照黄牛DNA均被检出且Ct值无显著差异（P＞0.05），表明即使扩增体系中DNA模板含量高达1000 ng，PCR也未受抑制。含0.1%和0.05%转基因大豆GTS-4-3-2的样品分别添加10 ng和100 ng模板即可检出。含0.01%转基因大豆GTS-4-3-2的样品需要将模板量添加至1000 ng时才可检出GTS-4-3-2品系特异性基因，而低于此含量后，0.005%和0.001%的样品GTS-4-3-2品系特异性基因检出率极低（表2）。即95%置信区间下，当模板添加量为1000 ng时，LLP转基因大豆GTS-4-3-2的realtime PCR定性检测限为0.01%，低于其他报道中的realtime PCR检测方法。表明即使扩增体系中DNA模板含量高达，PCR也未受抑制。

2 数字PCR的定性检测限和定量检测限

分别对含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%转基因大豆GTS-4-3-2的样品进行数字PCR定量时，在内外源基因阴性对照及空白对照无扩增的情况下，所有转基因大豆GTS-4-3-2样品Lectin基因定量结果的3 次重复RSD值均在5%以内，表明所有操作精密度较好，定量结果较为可靠。含0.1%转基因大豆GTS-4-3-2样品定量结果为0.104%，相对误差和3 次重复RSD分别为4.015%和18.533%，小于目前国际通用的定量方法要求。含0.05%转基因大豆GTS-4-3-2样品的相对误差和3 次重复RSD分别为42.305%和61.171%，不符合转基因定量中相对误差在25%以内的要求，结果仅可作为样品中转基因大豆GTS-4-3-2品系LLP的含量参考。而3 次重复定量的0.01%样品均出现阳性结果（表3）。表明本研究建立的数字PCR方法对LLP转基因大豆GTS-40-3-2样品的定量检测灵敏度可达0.1%，定性检测限则可达0.01%。

3 数字PCR定量方法的精密度和重复性

为验证所建立的ddPCR方法对低含量转基因大豆的定量检测精密度，在重复性条件下，用同样的方法、相同的测试环境下，很短的时间间隔内得到测试结果的相关数据，每个样品平行检测6 次。含0.1%转基因大豆GTS-4-3-2六个平行样品的定量结果分别为0.102%、0.081%、0.104%、0.112%、0.094%和0.118%，所有样品的3 次重复RSD在11.28%～22.75%之间，与实际含量的相对误差值在-10.55%～24.12%之间（图1a）。

含0.1%转基因大豆GTS-4-3-2样品的相对误差和RSD均小于常规定量要求的25%，表明该方法即使在对低含量的样品进行重复定量时，其精密度和稳定性均较为理想。含0.05%转基因大豆GTS-4-3-2六个平行样品定量结果分别为0.026%、0.063%、0.046%、0.025%、0.033%、0.027%、0.034%，所有样品的3 次重复RSD在43.98%～67.54%之间，与实际含量值的偏差在-50.00%～26.00%之间（图1b），定量精密度和定量值波动范围超过国际通用定量要求，但在日常可操作的前提下，也可实现半定量，对LLP样品的筛查检测和出入境贸易可以提供一定参考依据。

4 转基因大豆GTS-40-3-2LLP定量的不确定度

日常可接受的操作范围内，本研究分别对质量分数不小于0.1%和0.05%的转基因大豆GTS-40-3-2样品进行LLP定量研究，因此以下将分开计算这两种不同含量样品的定量不确定度。

根据ISO导则35、ISO/TS 21748:2017和我国相关标准，对转基因产品LLP检测的不确定度进行评定。转基因产品LLP定量检测过程带来的合成不确定度由两部分组成，第一部分是通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计方法计算出的A类不确定度；第二部分是通过对测量影响因素的分析，以非统计分析方法评定的B类不确定度。

4.1 A类不确定度

由于数字PCR为终点计数的绝对定量，传统realtime PCR定量方法中需考虑的内外源基因标准曲线不确定度、样品批内Ct值不确定度、PCR扩增效率的不确定度等都无需考虑。因此其A类不确定度表示为：

式中：μa为标准不确定度；为n 次含量测定值的算术平均数，n≥6；x为每次含量测定值；i为测定序号；n为平行测量次数。

由2.4节可计算出6 次重复的含0.1%转基因大豆GTS-40-3-2定量的A类相对不确定度uAr0.1%为0.1152，而6 次重复的0.05%转基因大豆GTS-40-3-2定量的A类相对不确定度应uAr0.05%为0.5359。

4.2 B类相对不确定度

采用的数字PCR仪器为Bio-Rad QX200微滴式数字PCR，因此B类不确定度的来源主要有微滴体积引入的测量不确定度、配制样品时天平变动性引入的不确定度、数字PCR仪器校准引入的不确定度。、

微滴体积引入的测量不确定度

本研究采用的数字PCR仪器微滴体积引入的测量不确定度u体积为常数1.40%。

配制样品时天平变动性引入的不确定度

天平变动性产生的不确定度：由天平的检定证书可知其变动性为0.1 mg，按照矩形分布，则

样品净质量为2 次称量操作所得。每次称质量均为独立观测结果，故计算两次为：

天平的最大允差产生的不确定度：由天平检定证书可知其最大允差为0.15 mg，按照矩形分布，则u1最大允差同样，样品净质量为两次称量操作所得。每1 次称质量均为独立观测结果，故计算两次为：

称量10、1、0.5 g大豆产生的相对不确定度分别为：

合成称量产生的相对不确定度：

数字PCR仪器校准引入的不确定度

根据仪器校准证书可知，本实验所用的Bio-Rad QX200微滴式数字PCR校准不确定度u校准为2.03%。

本研究中数字PCR定量GTS40-3-2的B类不确定度由上述3 个分量组成，其合成标准不确定度则表示为：

0.1%及以上转基因大豆GTS-40-3-2定量的合成相对不确定度应为：

含0.05%的转基因大豆GTS-40-3-2定量的合成相对不确定度应为：

取包含因子k=2（置信区间95%），则结果报告为0.1%转基因大豆GTS-40-3-2定量扩展不确定度为23.56%，0.05%的转基因大豆GTS-40-3-2定量的扩展不确定度为107.29%。

有效的转基因成分定量检测方法无疑是对转基因大豆进行LLP检测和实施标识制度最直接的技术保障。数字PCR步骤繁琐，检测通量比real-time PCR低，因此在转基因成分定性检测中，仍然不及real-time PCR优势明显。但数字PCR技术由于将含有DNA模板的微量样品进行稀释以及分液，分布到大量的独立反应室中进行扩增，极大降低了反应间的相互抑制，提高了反应效率。数字PCR可以对样品进行绝对定量分析，比real-time PCR仅依靠标准曲线确定转基因成分含量更加准确。因此，本研究开展了从DNA提取到定量全过程的系统性转基因大豆GTS-40-3-2的LLP检测研究，定性检测样品中的转基因LLP时仍然推荐real-time PCR方法，定性检测限基本与数字PCR一致，可低至0.01%。定量检测时数字PCR优势明显，可对含0.1%转基因的样品进行准确定量，即使是低至0.05%的转基因大豆GTS-40-3-2样品仍可进行半定量，其定性和定量灵敏度低于已发表文章中的检测限，也低于国内外的现行标识最低阈值。且本研究采用的检测方法对实验室和人员要求较为宽松，因此建立的定量方法在转基因大豆GTS-40-3-2的LLP检测中具有比realtime PCR更大的实际应用价值。

对于LLP的定量检测，实验中考虑测量值的不确定度非常有必要。采用数字PCR检测时，不受标准样品、内外源基因拷贝数、标准曲线及PCR扩增效率的不确定度影响，因而定量结果更为可靠。本研究对0.1%和0.05%的GTS-40-3-2品系转基因大豆原料进行定量检测的扩展不确定度分别为23.56%和107.29%。在实际检测中，若样品为加工食品时，则还需考虑样品的基质效应及食品加工过程中带来的DNA断裂、降解等产生的不确定度。对于这些因素，目前的科学手段还无法描述，因此在实际检测过程中，难以给出加工食品LLP定量的不确定度。