食品界

Introduction

2型糖尿病（T2D）是慢性胰岛素抵抗和β细胞功能及质量丧失的结果。胰岛素抵抗往往与能量代谢受损有关，导致细胞内脂肪含量增加，骨骼肌（SkM）、肝脏、脂肪和胰岛功能障碍。骨骼肌是餐后胰岛素介导的葡萄糖处置的主要组织。近年来，天然存在的多酚类化合物由于在各种人类疾病中具有潜在的有益作用而成为药物研究的焦点，其中相当一部分用于治疗糖尿病。

山奈酚是一种天然存在的黄酮醇。黄酮醇可以通过其羟基和氨基酸残基间形成氢键直接与蛋白质和酶相互作用，从而调节蛋白质功能。在对培养细胞的研究中发现，山柰酚可以保护成骨细胞免受氧化剂引起的损伤，并防止脂毒性诱导的β原子电池功能障碍。此外，山柰酚被证明可以发挥抗炎、脂解、抗高血压和对癌细胞的抗增殖作用，以及促进能量消耗和甲状腺激素激活。然而，评估山柰酚抗糖尿病作用的研究有限，其抗糖尿病作用的机制尚不完全清楚。虽然作者发现山柰酚抑制肝脏糖异生，这可能部分归因于其对血糖，特别是空腹高血糖的有益作用，但其对全身胰岛素敏感性的促进作用尚不清楚。由于SkM的胰岛素抵抗在T2D的发病机制中发挥重要作用，本研究探讨山奈酚是否促进SkM的葡萄糖摄取，并进一步探讨其作用机制。

Results

山奈酚增加人原代SkM细胞对葡萄糖的摄取

与对照组相比，山奈酚处理能够显著增加葡萄糖摄取（图1A）。大量证据表明，循环游离脂肪酸损害胰岛素信号传导，阻碍肌肉内葡萄糖转运。本实验进一步利用分化肌管确定山柰酚是否可以减轻脂肪酸对胰岛素诱导的葡萄糖摄取的损伤。发现脂肪酸暴露会损害人原代SkM细胞对葡萄糖的摄取，但山柰酚可以显著减弱这种不利影响（图1B）。

图1 山奈酚促进SkM细胞的葡萄糖摄取（A），山奈酚处理逆转高脂肪酸损伤的SkM细胞葡萄糖摄取（B）

山奈酚诱导的葡萄糖摄取由PI3K/Akt依赖性机制介导

Akt在胰岛素刺激的葡萄糖摄取中发挥重要作用。山奈酚诱导人SkM细胞中Akt磷酸化水平迅速升高。Akt磷酸化水平在山奈酚孵育10 min时达到峰值，并在60 min后恢复到基础水平（图2A和B）。鉴于山奈酚诱导Akt磷酸化，Akt通过诱导Glut4转位到肌膜介导胰岛素刺激的葡萄糖摄取，检测Akt是否参与介导山奈酚对葡萄糖摄取的影响。结果发现抑制PI3K可阻断胰岛素或山奈酚刺激的肌细胞葡萄糖摄取（图2C）。用Glut4的抑制剂茚地那韦孵育细胞，阻断了胰岛素或山奈酚刺激的葡萄糖摄取（图2D）。

图2 山奈酚诱导的葡萄糖摄取通过PI3K/Akt依赖机制介导

山奈酚诱导的葡萄糖摄取由AMPK的激活介导

通过评估AMPK的化学抑制剂Compound C对这种山奈酚介导的作用的影响，检测AMPK是否在山奈酚刺激的葡萄糖摄取中发挥作用。结果发现化合物C通过抑制AMPK在很大程度上消除了山奈酚刺激的葡萄糖摄取（图3A）。此外，在增加葡萄糖摄取的相同剂量下，山奈酚显著增加AMPK磷酸化，如图3B所示。

图3 山柰酚对葡萄糖摄取的影响依赖于AMPK（A），山奈酚在肌细胞中诱导快速的AMPK活性（B）

急性口服山奈酚改善肥胖小鼠的糖耐量并激活SkM中的Akt和AMPK

为了确定观察到的山奈酚的体外效应是否具有生理相关性，本实验评估了急性口服山奈酚是否在体内调节肌肉Akt和AMPK磷酸化中的葡萄糖处置。实验发现，急性口服山柰酚显著降低血糖水平（图4A），而血胰岛素水平没有改变（图4B），表明山柰酚的降血糖作用不是通过增加胰岛素分泌来实现的。山奈酚还可诱导红色SkM的Akt磷酸化（图4C~D）。同样，山奈酚急性给药增加了SkM中AMPK的磷酸化（图4E~F）。

图4 山柰酚急性给药对肥胖小鼠血糖、胰岛素及SkM中Akt、AMPK磷酸化的影响

Discussion

本研究进一步证明了山奈酚直接刺激SkM对葡萄糖的摄取。山奈酚对葡萄糖摄取的影响是通过AMPK依赖的PI3K/Akt/Glut4级联的激活介导的，而PI3K/Akt/Glut4级联是胰岛素启动信号的标志。血浆游离脂肪酸升高被认为在胰岛素抵抗的发生中起重要作用。结果表明，山柰酚在SkM中发挥胰岛素样作用。鉴于SkM中的胰岛素抵抗在T2D的发病机制中起着关键作用，山柰酚可能是一种低成本的天然化合物，可以促进SkM的胰岛素敏感性，从而预防T2D。

此外山柰酚增加AMPK的磷酸化，而Compound C抑制AMPK可以抑制山柰酚刺激的葡萄糖摄取，这证明了AMPK在介导山柰酚影响葡萄糖摄取中的重要作用。在Glut4抑制剂存在的情况下，山奈酚刺激的葡萄糖摄取被消融。虽然结果表明山奈酚刺激肌细胞AMPK依赖的葡萄糖摄取是通过胰岛素信号通路介导的，但没有直接的证据表明山奈酚刺激PI3K/AKT磷酸化是通过AMPK依赖的机制介导的。因此，山柰酚可能同时激活AMPK和PI3K/Akt通路（图5）。数据还显示，长时间的山奈酚处理降低了Akt的磷酸化。这种效应的机制尚不清楚。山奈酚长时间暴露可能增强胰岛素受体脱敏、蛋白酶体介导的IRS1/2降解或磷酸酶介导的去磷酸化。

体内外研究结果表明山奈酚的降血糖作用至少部分是由于刺激了SkM的葡萄糖摄取，尽管不能排除急性给予山奈酚也可能抑制肝脏糖异生的可能性。然而，快速给予山奈酚是否直接靶向SkM诱导葡萄糖摄取是其在小鼠体内发挥降糖作用的主要原因，仍有待确定。而且在SkM细胞中，山奈酚是通过直接作用还是通过间接机制刺激AMPK磷酸化，还需要进一步研究。目前尚不清楚在体外和体内研究中观察到的有效浓度有如此大的差异的确切原因，但为了达到体内观察到的效果所必需的山奈酚浓度可能远远低于体外类似作用所需的浓度。也有可能肌肉组织中的山奈酚浓度可能远高于循环中的山奈酚浓度，有待进一步研究。

综上所述，本研究表明山奈酚可通过AMPK和PI3K/Akt介导的机制刺激SkM细胞快速摄取葡萄糖。研究结果为山奈酚改善肥胖糖尿病小鼠的胰岛素敏感性和血糖控制提供了证据，表明该天然化合物可以作为一种低成本的改善T2D的药物。

图5 山奈酚诱导骨骼肌细胞急性葡萄糖摄取的机制

Kaempferol improves glucose uptake in skeletal muscle via an AMPK-dependent mechanism

William T. Moore^a,b, Jing Luo^a, Dongmin Liu^a,c,^*

^a Department of Human Nutrition, Foods and Exercise, College of Agricultural and Life Sciences, Virginia Tech, Blacksburg 24060, USA

^b Department of Biology and Chemistry, Liberty University, Lynchburg 24515, USA

^c Department of Human Nutrition, Foods and Exercise, Virginia Tech, 1981 Kraft Drive, Corporate Research Center, Blacksburg 24061, USA

*Corresponding author.

Abstract

Insulin resistance is a hallmark of type-2 diabetes (T2D) pathogenesis. Because skeletal muscle (SkM) is the major tissue for insulin-mediated glucose disposal, insulin resistance in SkM is considered a major risk factor for developing T2D. Thus, the identification of compounds that enhance the ability of SkM to take up glucose is a promising strategy for preventing T2D. Our previous work showed that kaempferol, a flavonol present in many foods, improves insulin sensitivity in obese mice, however, the mechanism underlying this beneficial action remains unclear. Here, we show that kaempferol directly stimulates glucose uptake and prevents lipotoxicity-impaired glucose uptake in primary human SkM. Kaempferol stimulates Akt phosphorylation in a time-dependent manner in human SkM cells. The effect of kaempferol on glucose uptake was blunted by inhibition of glucose transporter 4, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), or AMPK. In addition, kaempferol induced AMPK phosphorylation, and inhibition of AMPK prevented kaempferol-stimulated Akt phosphorylation. In vivo, kaempferol administration induced rapid glucose disposal accompanied with increased Akt and AMPK phosphorylation in SkM tissue of the mice. Taken together, these findings suggest that kaempferol stimulates glucose uptake in SkM via an AMPK/Akt dependent mechanism, and it may be a viable therapeutic agent for insulin resistance.

Reference:

MOORE W T, LUO J, LIU D M, et al. Kaempferol improves glucose uptake in skeletal muscle via an AMPK-dependent mechanism[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2087-2094. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.028.