食品界

肿瘤靶向和GSH刺激反应α-乳清蛋白纳米管共同递送阿霉素和siRNA用于癌症治疗

Abstract

α-乳清蛋白（α-lac）是一种天然食物来源的蛋白质，作为小生物活性分子或 RNA 的递送系统，具有很高的生物相容性。然而，由于缺乏对所需组织（如肿瘤）的靶向，它们作为递送系统的潜在临床应用受到很大限制。在这里，通过从α-lac水解的肽的自组装来制备纳米管（NT）的递送系统/纳米载体。在阿霉素（Dox）和siRNA的抗肿瘤药物的负载中，NTs与tLyp-1肽偶联，特异性靶向存在于MDA-MB-231癌细胞膜上的神经纤毛蛋白1受体。NTs的微观形貌在加载和靶向修饰过程中不受影响。此外，当tLyp-1/NTs/Dox/siRNA纳米载体在磷酸盐缓冲盐水中储存7天时，其大小和Zeta电位没有显著变化，表明其出色的稳定性。此外，NTs对MDA-MB-231乳腺癌细胞的细胞摄取效率和肿瘤蓄积效应均在tLyp-1修饰后显著改善。用 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA（5 μg/mL Dox）处理后，MDA-MB-231细胞的相对活力在体外降低了70.1%。最后，在MDA-MB-231荷瘤小鼠的抗癌治疗中，实现了tLyp-1/NTs中共载的Dox和siRNA的协同抗癌作用。这些发现表明，食源蛋白α-lac纳米载体可用于生物活性分子和RNA的共递送，实现协同和高效的治疗效果。

Introduction

纳米载体作为功能性食品或特殊医疗用药物中生物活性成分的递送系统，备受关注。然而，设计纳米载体的几个挑战，如来源可再生性、可持续性、生物相容性或这些特性的组合，仍有待解决。由蛋白质等食品成分衍生材料形成的纳米载体具有低成本、高生物相容性和生物降解性等优点。此外，研究表明，长度较短的α-lac NTs比长NTs和纳米球更有利于吸收。然而，食源性蛋白质递送系统仍需要进一步修改，以便靶向递送至特定细胞或组织，用于药物应用。

癌症占全球死亡人数的大多数，估计到 2030 年将有 1700 万人死于癌症。目前，化疗、放疗和手术通常是最有效的治疗策略。由于放射治疗和外科手术的侵入性，抗肿瘤药物的应用仍然是癌症治疗最关键的选择。阿霉素（Dox）通常用作干预转移性癌症的化疗药物。然而，Dox的心脏毒性和耐药性限制了其临床应用。最近，小干扰RNA（siRNA）与Dox联合用于干扰多种肿瘤信号通路，并沉默关键信号分子的基因表达。Dox与siRNA的结合可以通过协同效应克服多药耐药性。这种联合策略可以通过不同的分子机制治疗癌症，从而提高抗肿瘤效率。然而，脱靶效应仍然是一个巨大的挑战，必须通过适当的设计、合成和优化递送系统来解决。总体而言，递送效率低、脱靶和严重副作用的缺点限制了这些递送系统的临床应用。因此，迫切需要寻找更多的生物相容性生物材料作为癌症药物递送系统。此外，在食品和制药领域的应用需要一种非合成路线来设计天然来源的纳米载体。

本文开发了一种由食源α-lac形成的NT纳米载体，用于Dox和siRNA的共递送（图1）。首先，NTs由地衣芽孢杆菌蛋白酶（BLP）水解的α-lac肽自组装而成。Dox在自组装过程中通过疏水相互作用（NTs/Dox）封装在NTs的疏水内核中。然后，将肿瘤靶向肽tLyp-1共价移植到NTs表面（tLyp-1/NTs/Dox）。最后，DL-二硫苏糖醇（DTT）可以还原NTs表面的二硫键，并通过氧化（tLyp-1/NTs/Dox/siRNA）与NTs表面的内源半胱氨酸形成新的二硫键，从而负载巯基-siRNA。当tLyp-1/NTs/Dox/siRNA纳米载体被肿瘤细胞摄取时，siRNA在细胞内谷胱甘肽（GSH）高浓度的降低下反应性释放，可沉默关键基因并抑制存活素蛋白的表达。与此同时，Dox从纳米载体中释放出来，发挥了抗肿瘤作用。在体外研究了 Dox 和 siRNA 从 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 中的释放行为，以及 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 的细胞毒性和细胞摄取。此外，还研究了tLyp-1/NTs/Dox/siRNA在体内的生物分布。最后，探讨了tLyp-1/NTs/Dox/siRNA在MDA-MB-231荷瘤小鼠中的抗肿瘤效率。

图1 肿瘤靶向的tLyp-1/NTs/Dox/siRNA纳米载体的示意图

Results and discussion

Dox 和 siRNA 负载纳米管的表征

NTs纳米载体的微观形貌如图2A所示。纳米载体的管状微观结构在存在或不存在Dox和siRNA的情况下保持不变。虽然NTs的长度变化可以忽略不计，但tLyp-1/NTs/Dox/siRNA的厚度高于纯NTs的厚度，如TEM图像所示。这可能是由于 Dox 和 siRNA 的上样，以及 tLyp-1 肽的偶联，这增加了 NT 的厚度。此外，由于siRNA的接枝，NTs的表面电荷从-24.4 mV逆转到3.4 mV（图2B），导致NTs聚集和厚度增加。在之前的工作中也观察到了类似的结果，该研究表明，由于羟基磷灰石/聚乙烯亚胺（PEI）纳米棒和核酸的桥接团聚，尺寸分布增加。siRNA接枝后Dox负载效率无显著变化（tLyp-1/NTs/Dox：5.05%，tLyp-1/NTs/Dox/siRNA：4.92%;表S2）。使用凝胶延迟测定法评估最佳电荷比。图2C 表明 NTs 与 siRNA 的最佳络合比为 20：1 （m/m）。此外，tLyp-1/NTs/Dox/siRNA在PBS中储存7天时，其大小和Zeta电位变化可以忽略不计（图2D）。tLyp-1/NTs/Dox/siRNA稳定性的提高可能归因于NTs和siRNA表面内源性二硫键的再交联此外，储存 7 天后没有发生颜色变化和沉淀，表明 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 具有出色的稳定性，这为其在体内的进一步应用铺平了道路（图 2E）。

图2 上样 Dox 和 siRNA 前后 NTs 纳米载体的表征。（A）透射电镜观察NTs和tLyp-1/NTs/Dox/siRNA的微形态。（B） tLyp-1/NTs/Dox/siRNA制备过程中各种纳米载体的Zeta电位变化。数据表示 SD ±平均值（n = 3）。（C）琼脂糖凝胶电泳分析重量比为 20：1、15：1、10：1、5：1 和 0：1 的 NTs/siRNA （NTs：siRNA）。裸siRNA作为对照。（D） tLyp-1/NTs/Dox/siRNA在PBS中7 d的大小和Zeta电位的储存稳定性。数据表示 SD ± 的平均值（n = 3）。（E）在 PBS 中储存 7 天的 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 图像

纳米载体中 Dox 和 siRNA 的 GSH 响应性释放

据报道，癌细胞中谷胱甘肽的浓度远高于正常细胞。为了模拟肿瘤细胞中较高的GSH浓度，在进行Dox释放实验之前，将10 mmol/L GSH加入PBS（pH 7.4）中。如图3A所示，添加GSH破坏了tLyp-1/NTs/Dox/siRNA的结构，导致Dox和siRNA的相应释放。这种破坏是由于 GSH 的还原活性而发生的，GSH可以裂解 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA中siRNA 和 NT 之间的交联二硫键。在GSH存在下，42 h时Dox的最大释放量达到81.07%，而没有GSH时仅释放了40.86%的Dox（图3B）。通过琼脂糖凝胶电泳定性测定siRNA的释放。当NTs与siRNA的重量比为20：1时，相应的条带消失。然而，添加 10 mmol/L GSH 或 DTT 后出现条带（图 3C）。由于DTT的还原活性比GSH更强，添加DTT后的siRNA条带比添加GSH后更亮。这些结果表明，siRNA和Dox的释放表现出GSH反应行为，这有利于它们在癌细胞中的响应性释放。

图3 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA纳米载体的GSH响应性释放曲线。（A）添加10 mmol/L GSH前后tLyp-1/NTs/Dox/siRNA的TEM照片。（B）体外 GSH 触发的 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 累积释放 Dox。数据表示 SD ± 的平均值（n = 3）。**** P < 0.000 1.（C）对 10 mmol/L GSH 或 DTT 触发的 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 释放的 siRNA 进行琼脂糖凝胶电泳。

乳腺癌细胞对 NT 和 tLyp-1/NTs 的摄取

人乳腺癌细胞MDA-MB-231对NTs和tLyp-1/NTs的细胞摄取结果如图4所示。显然，用tLyp-1/NTs孵育的细胞在细胞质中显示出比用NTs处理的细胞更多的红色荧光信号（图4A），表明tLyp-1/NTs可以有效地靶向肿瘤细胞。流式细胞术结果也证实，肿瘤靶向肽（tLyp-1）可以改善MDA-MB-231细胞中NTs的摄取（图4B）。tLyp-1/NTs/Cy5的细胞摄取效率高于NTs/Cy5，这可能是由于tLyp-1肽与MDA-MB-231细胞膜上的神经纤毛蛋白1（NRP1）受体之间的特异性识别。这些结果表明，tLyp-1/NTs纳米载体在抗癌治疗中具有巨大的靶向药物递送潜力。

图4 MDA-MB-231 细胞中 tLyp-1/NTs 和 NT 的细胞摄取。（A）孵育 4 小时后 MDA-MB-231 细胞中细胞摄取 tLyp-1/NTs/Cy5 和 NTs/Cy5 的 CLSM 图像。细胞核和纳米载体分别用Hoechst 33342（蓝色）和Cy5（红色）标记。（B）与 tLyp-1/NTs/Cy5 或 NTs/Cy5 孵育 4 小时的 MDA-MB-231 细胞的流式细胞法

NTs纳米载体在MDA-MB-231细胞中的细胞毒性

将tLyp-1/NTs/Dox/siRNA与MDA-MB-231细胞孵育24 h，评估纳米载体在细胞水平上的抗癌作用。首先，通过CCK-8测定法对细胞毒性进行定量。如图5A所示，即使在最高浓度（相当于5 μg/mL Dox）下，在NTs和NTs/siRNA中也未观察到明显的细胞毒性。然而，Dox对癌细胞表现出一定的细胞毒性。有趣的是，当 Dox 和 siRNA 共载到 tLyp-1/NTs 中时，在 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 中观察到协同抗癌作用。具体而言，与游离Dox和siRNA处理组（分别为49.77%和98.54%）相比，tLyp-1/NTs/Dox/siRNA处理组的细胞活力显著下降至29.9%（图S1）。不含纳米载体的疏水性Dox吸收率低，导致抗癌作用有限。此外，siRNA可以在没有纳米载体保护的情况下迅速降解。在此，通过tLyp-1/NTs纳米载体将两者共载被证明具有保护和增强Dox和siRNA抗癌功效的能力。此外，通过活死人试验进一步研究了抗癌功效。如图5B所示，tLyp-1/NTs/Dox/siRNA处理组的死细胞面积（红色）明显大于其他组，尤其是NTs/Dox和NTs/siRNA组，表明在tLyp-1/NTs中共加载Dox和siRNA时实现了协同抗肿瘤作用，同时实现协同抗肿瘤作用。

图5 各种制剂对MDA-MB-231细胞的细胞毒性。（A）与不同浓度的各种制剂（NTs、游离 Dox、NTs/Dox、NTs/siRNA、NTs/Dox/siRNA 和 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA）一起孵育的 MDA-MB-231 细胞的细胞活力。**** P < 0.0001.数据表示 SD ±平均值（n = 6）。（B） MDA-MB-231 细胞在等效浓度为 5 μg/mL 下处理 4 小时后，对不同制剂进行活/死分析。活细胞是绿色的;死细胞是红色的。

NTs和tLyp-1/NTs在体内的生物分布

研究了Cy7标记的NTs和tLyp-1/NTs在MDA-MB-231细胞异种移植小鼠模型中的生物分布。如图6A所示，在静脉注射后1、2、4和8 h获得肿瘤部位NTs/Cy7和tLyp-1/NTs/Cy7在肿瘤部位的积累。尾静脉注射8 h后，肿瘤中tLyp-1/NTs/Cy7的荧光信号强于NTs/Cy7。在图6B中可以清楚地观察到切除肿瘤的这种差异，tLyp-1/NTs/Cy7组的荧光强度是NTs/Cy7组的1.1倍（图6C）。NTs和tLyp-1/NTs在肿瘤蓄积中的明显区别表明，tLyp-1可以增强NTs在体内对肿瘤的靶向能力，这与图4中的癌细胞摄取结果一致。

图6 Cy7 标记的 NT 和 tLyp-1/NTs 在 MDA-MB-231 荷瘤小鼠模型上的体内生物分布。（A）注射后 1、2、4 和 8 小时肿瘤异种移植小鼠模型中 NTs/Cy7 和 tLyp-1/NTs/Cy7 的代表性荧光图像。（B） Cy7标记的NTs和tLyp-1/NTs在主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤中8 h尾静脉注射后的荧光图像和（C）荧光强度。

tLyp-1/NTs/Dox/siRNA在体内的抗肿瘤功效

在MDA-MB-231细胞异种移植小鼠模型中进一步评估了tLyp-1/NTs/Dox/siRNA纳米载体的抗癌效率。如图7A和B所示，与其他组相比，PBS组的肿瘤生长最快。虽然对于游离的 Dox、siRNA 或它们的组合，观察到肿瘤生长略有抑制，这可能是 Dox 和 siRNA 的高代谢率所致。值得注意的是，当以等效的 5 μg/mL Dox 浓度加载到 NT 中时，NTs/Dox/siRNA 和 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 组的肿瘤生长受到显着抑制。tLyp-1移植的NTs显示出比其他样本更好的肿瘤抑制作用。存活素在癌细胞中高度表达，是细胞凋亡蛋白的抑制剂，可阻断细胞死亡。在这里，纳米载体中装载的siRNA被应用于沉默和下调存活素蛋白的表达。因此，为了阐明肿瘤抑制是否与siRNA下调存活素有关，从各种制剂处理后的肿瘤组织中提取存活素蛋白，并通过Western blot进一步分析存活素蛋白的表达。如图7C和D所示，游离Dox、siRNA和Dox/siRNA处理组的存活素蛋白表达没有降低。然而，它在NTs/Dox/siRNA和tLyp-1/NTs/Dox/siRNA组中几乎消失。NTs/Dox/siRNA和tLyp-1/NTs/Dox/siRNA的存活素蛋白表达分别下降了60.9%和71.4%。siRNA可能的抗肿瘤机制是siRNA干扰存活素蛋白的mRNA，从而阻断存活素蛋白的表达，最终促进MDA-MB-231癌细胞凋亡。

此外，组织学结果显示，与其他制剂（游离 Dox、siRNA、Dox/siRNA 和 NTs/Dox/siRNA）相比，tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 处理后实体瘤细胞的细胞核（紫色）减少，表明 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA 具有最佳的抗肿瘤作用（图7E）。最重要的是，在tLyp-1/NTs/Dox/siRNA处理的主要器官中没有观察到副作用（图S2）。免疫荧光结果还显示，Lyp-1/NTs/Dox/siRNA处理后，细胞增殖（Ki-67组的空白区域）和凋亡细胞信号（TUNEL组的绿色）下降最为显着（图7E）。所有这些结果表明，当Dox和siRNA共载于tLyp-1/NTs纳米载体中时，它们具有协同抗肿瘤作用。一般而言，tLyp-1/NTs/Dox/siRNA可有效降低存活素蛋白的表达，最终促进癌细胞凋亡。

图7 各种纳米载体对MDA-MB-231荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用。用各种制剂（PBS、Dox、siRNA、Dox/siRNA、NTs/Dox/siRNA 和 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA）处理后，携带 MDA-MB-231 的小鼠肿瘤的体积（A）和权重（B）（C） Western blot检测的肿瘤组织中存活素的蛋白水平。（D）用不同制剂（PBS、Dox、siRNA、Dox/siRNA、NTs/Dox/siRNA 和 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA）处理后存活素蛋白的蛋白质印迹分析。（E）用 PBS 和其他制剂（游离 Dox、siRNA、Dox/siRNA、NTs/Dox/siRNA 和 tLyp-1/NTs/Dox/siRNA）处理后肿瘤组织的 HE、Ki-67 和 TUNEL 染色分析。数据表示为平均值 ± SD （n = 8）， * P < 0.05， ** P < 0.01， **** P < 0.000 1。

Conclusion

综上所述，制备了一种食源性α-lac NTs纳米载体，用于Dox和siRNA抗肿瘤药物的共递送。将肿瘤靶向肽 tLyp-1 掺入 NT 表面，可将 Dox 和 siRNA 精确递送至 MDA-MB-231 细胞。我们的研究结果表明，tLyp-1/NTs/Dox/siRNA纳米载体对肿瘤微环境有反应，特别是癌细胞胞质内的高GSH浓度，导致随后释放负载的Dox和siRNA。tLyp-1/NTs/Dox/siRNA可以靶向并积累到MDA-MB-231细胞上，这些细胞在体外通过CLSM和流式细胞术进行表征。最后，证实了tLyp-1/NTs/Dox/siRNA在MDA-MB-231细胞异种移植小鼠模型中具有协同增强Dox和siRNA抗肿瘤作用的能力。此外，通过Western blot分析下调存活素蛋白的表达。这项研究表明，牛奶蛋白衍生的纳米载体作为共递送生物活性分子和siRNA的有效平台的潜力，为化疗和基因治疗联合治疗癌症提供了广阔的前景。

Tumor targeted and GSH stimuli-response α‑lactalbumin nanotubes co-delivering doxorubicin and siRNA for cancer therapy

Guohua Hou^a, Di Wu^c, Xing Li^a,*, Bin Liu^a,b^,*

^a Research Center of Food Colloids and Delivery of Functionality, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

^b Department of Nutrition and Health, China Agricultural University, Beijing 100193, China

^c Department of Health Sciences and Technology, Eidgenössische Technische Hochschule Zürich, Zürich 8092, Switzerland

*Corresponding authors.

Abstract

α-Lactalbumin (α-lac), a natural food-sourced protein, exhibits high biocompatibility as delivery systems for small bioactive molecules or RNA. However, their potential clinical application as a delivery system is greatly limited due to the lack of targeting to desired tissues, such as tumors. Here, a delivery system/nanocarrier of nanotube (NT) was fabricated by the self-assembly of peptides hydrolyzed from α-lac. Among the loading of anti-tumor agents of doxorubicin (Dox) and siRNA, NTs were conjugated with the tLyp-1 peptide to specifically target the neuropilin 1 receptor, which exists on the membrane of MDA-MB-231 cancer cells. The micromorphology of NTs was not affected during the processes of loading and targeting modification. Additionally, no significant changes in the size and zeta potential of the tLyp-1/NTs/Dox/siRNA nanocarrier were observed when stored in phosphate buffered saline for 7 days, indicating outstanding stability. Moreover, both the cellular uptake efficiency and tumor accumulation effects of NTs on MDA-MB-231 breast cancer cells were significantly improved after modification with tLyp-1. The relative viability of MDA-MB-231 cells was decreased by 70.1% in vitro after treatment with tLyp-1/NTs/Dox/siRNA (5 μg/mL Dox). Finally, a synergistic anticancer effect of Dox and siRNA co-loaded in tLyp-1/NTs was achieved in the anticancer treatment of MDA-MB-231 tumor-bearing mice. These findings indicate that food-sourced protein α‑lac nanocarriers could be used for the co-delivery of bioactive molecules and RNA, achieving synergistic and efficient therapeutic effects.

Reference:

HOU G H, WU D, LI X, et al. Tumor targeted and GSH stimuli-response α‑lactalbumin nanotubes co-delivering doxorubicin and siRNA for cancer therapy[J]. Journal of Future Foods, 2024, 4(4): 300-308. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.11.002.