食品界

鞣花酸通过调节炎症和SIRT6/TNF-α信号改善顺铂诱导的急性肾损伤

Introduction

作为一种经典的DNA损伤剂，顺铂诱导多重交联效应来抑制癌细胞中的DNA合成和RNA转录，从而导致细胞分裂受损和细胞凋亡。然而，由于其严重的剂量限制性副作用，特别是肾毒性，顺铂可能不足以实现期待的临床价值。因此，寻找新的针对顺铂肾毒性的靶向治疗方法具有重要意义。

去乙酰化酶6（SIRT6）是NAD⁺依赖性酶中的一员，在基因表达、基因组维持、炎症和细胞代谢等多种生物学过程中发挥关键作用。前期研究发现，过表达SIRT6可通过去乙酰化和抑制ERK1/2，从而抑制NF-κB和p53信号，减轻顺铂诱导的急性肾损伤，为顺铂诱导的肾毒性提供了新的治疗靶点。然而，在临床前研究中，SIRT6特异性激活剂非常少，目前还没有SIRT6特异性激活剂应用于临床治疗。因此，需要开发新型的SIRT6激活剂来治疗顺铂诱导的肾毒性。

鞣花酸（EA）是一种天然多酚类化合物，广泛存在于各种水果中。最近的一项研究证实，鞣花酸可以显著增加人结肠腺癌细胞中SIRT6的去乙酰化酶活性。因此，本研究推测鞣花酸可能通过激活SIRT6发挥肾脏保护作用。然而，关于鞣花酸对顺铂诱导的肾毒性的影响的信息很少。在本研究中，我们证明了鞣花酸能否改善顺铂诱导的急性肾损伤及其分子机制。

Results

鞣花酸减弱顺铂对肾细胞的细胞毒性

如图1所示，鞣花酸和顺铂共同处理的细胞存活率显著高于单独使用顺铂处理的细胞，这表明鞣花酸预处理可以减弱顺铂在原代肾细胞和肾细胞系中的细胞毒性。

图1 鞣花酸减弱顺铂对肾细胞的细胞毒性

鞣花酸改善顺铂诱导的小鼠急性肾损伤

首先，通过测定小鼠血清中的肌酐（CREA）和尿素氮（BUN）来检测潜在的肾功能障碍。如图2所示，顺铂处理显著增加了CREA和BUN的浓度，表明顺铂诱导的肾功能障碍。顺铂与鞣花酸合用可显著降低血清中CREA和BUN的浓度，证实鞣花酸预处理可改善顺铂诱导的肾功能损伤。此外，通过苏木精和伊红染色直接显示肾脏损伤。如图2B所示，与对照组相比，顺铂单独处理的小鼠出现了明显的组织病理学变化。此外，鞣花酸预处理显著降低了顺铂诱导的组织病理学变化，表明鞣花酸对CP诱导的肾损伤具有保护作用。

图2 鞣花酸改善顺铂诱导的小鼠急性肾损伤

如图3A和3B所示，顺铂处理显著诱导肾脏的纤维化和细胞凋亡，而鞣花酸预处理可显著改善顺铂诱导的纤维化和细胞凋亡。此外，通过BAX和Bcl-2的mRNA水平进一步检测顺铂诱导的细胞凋亡。如图3C所示，顺铂增加的BAX和顺铂降低的Bcl-2被鞣花酸显著逆转。如图3D所示，鞣花酸预处理TCMK-1细胞也降低了顺铂改变的BAX和Bcl-2表达。以上结果表明，鞣花酸可作为改善顺铂诱导的急性肾损伤的有效药物。

图3 鞣花酸改善顺铂诱导的小鼠细胞凋亡和纤维化

鞣花酸减轻顺铂诱导的炎症反应

如图4A和4B所示，顺铂处理后，血清和肾脏中IL-1β和IL-6水平显著升高，表明顺铂诱导的炎症反应。顺铂诱导的IL-1β和IL-6表达水平的增加被鞣花酸显著抑制，表明鞣花酸预处理有效抑制了顺铂诱导的炎症反应。如图4C所示，顺铂处理显著增加IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白水平。而鞣花酸预处理24h可显著降低顺铂诱导的IL-1β和IL-6水平，进一步证实了鞣花酸预处理可减轻顺铂诱导的肾毒性相关的炎症反应。

图4 鞣花酸减轻顺铂诱导的炎症反应

鞣花酸靶向SIRT6/TNF-α信号通路

小鼠经顺铂处理后，血清和肾脏中SIRT6水平显著降低。而鞣花酸预处理可显著逆转顺铂对血清和肾脏中SIRT6表达的抑制作用（图5A和5B），表明鞣花酸的肾脏保护作用可能与其对SIRT6表达的影响有关。

经不同浓度鞣花酸处理后，SIRT6的mRNA和蛋白水平均显著升高，且呈剂量依赖性。与体内结果类似，顺铂处理后SIRT6的mRNA和蛋白水平均显著降低，而鞣花酸预处理24 h可有效逆转这一现象（图5D和5F）。在TCMK-1细胞中的结果进一步证实了上调的SIRT6表达可能是鞣花酸发挥肾脏保护作用的分子机制。

图5 鞣花酸增加SIRT6的表达

如图6A和6B所示，顺铂处理的小鼠血清和肾脏中TNF-α的表达水平显著增加，尤其是肾脏，进一步表明肾毒性相关的炎症。并且共处理组小鼠的TNF-α表达水平显著低于顺铂处理组小鼠。在体外实验中也观察到类似的结果，如图6C和6D所示，TCMK-1细胞经顺铂处理后，TNF-α的mRNA和蛋白水平显著增加，而经鞣花酸处理后，可有效减少顺铂诱导的TNF-α表达。上述体内外实验结果证实，鞣花酸可调控肾细胞SIRT6/TNF-α信号通路，可能介导肾脏保护和抗炎作用。

图6 鞣花酸降低TNF-α的表达

鞣花酸通过与SIRT6结合减轻顺铂的肾毒性

在转染Ctrl siRNA的细胞中，鞣花酸和顺铂共同处理的细胞TUNEL阳性率明显低于单独使用顺铂处理的细胞。在转染SIRT6 siRNA的细胞中，鞣花酸的共处理不再抵抗顺铂诱导的细胞凋亡（图7A），表明SIRT6敲低可以抵消鞣花酸对顺铂诱导的细胞凋亡的保护作用，因此鞣花酸的肾脏保护作用主要依赖于鞣花酸介导的SIRT6激活。

为了明确SIRT6是否是鞣花酸的直接作用靶点，采用MOE-Dock模拟研究了鞣花酸与SIRT6的结合能力。结果表明鞣花酸与SIRT6的结合位点形成了合适的空间互补，对接得分为-5.0383 kcal/mol。此外，鞣花酸与SIRT6之间形成了氢键和Pi-Pi堆积作用。鞣花酸的OH基团中的氧原子作为氢键受体，与SIRT6中Phe86骨架中的氮原子形成氢键。Phe86的苯环与鞣花酸的氧杂环形成Pi-Pi堆积作用（图7B和C）。进一步说明鞣花酸可以直接与SIRT6结合，从而激活SIRT6来改善顺铂诱导的肾毒性。

图7 鞣花酸通过与SIRT6结合减轻顺铂的肾毒性

Discussion

尽管顺铂已被广泛用于多种癌症的治疗，但严重的肾毒性极大地限制了其临床使用。一般来说，顺铂的肾毒性有多种形式，如急性肾损伤、肾小管功能障碍、低镁血症、低钙血症、高尿酸血症、慢性肾功能衰竭等。其中，急性肾损伤是顺铂诱导的最常见和最严重的肾毒性。迄今为止，减轻肾毒性的标准做法是基于避免肾脏过度暴露于顺铂的原则，包括水化与生理盐水输注，甘露醇、呋塞米或镁的联合给药，以及通过血清铬清除率监测肾功能。然而，即使采用预防方法，肾毒性仍然会发生。因此，需要探索更有效的策略来对抗顺铂的肾毒性。

本研究发现鞣花酸可以通过降低顺铂诱导的炎症反应在体外和体内改善顺铂诱导的肾毒性。机制上，鞣花酸可上调SIRT6表达，下调TNF-α表达，有效逆转顺铂降低的SIRT6表达，减少顺铂诱导的TNF-α表达。结果证实了鞣花酸可以作为一种理想的药物，通过靶向SIRT6/TNF-α介导的炎症来改善顺铂的肾毒性。此外，分子对接实验结果证实，鞣花酸可直接与SIRT6结合，敲低SIRT6可明显取消鞣花酸对顺铂诱导的细胞凋亡的保护作用。结果进一步表明鞣花酸诱导的SIRT6 活化可能是鞣花酸发挥肾脏保护作用的分子机制。

迄今为止，针对鞣花酸的临床试验仍较少。因此，有必要进行额外的临床前和临床研究来评估鞣花酸的安全性和有效性。总之，本研究结果支持鞣花酸是改善顺铂诱导的肾毒性的理想药物，并为鞣花酸作为顺铂治疗肿瘤患者的辅助治疗提供了临床前证据。

Ellagic acid ameliorates cisplatin-induced acute kidney injury by regulating inflammation and SIRT6/TNF-α signaling

Yuqi Gao^a,1, Kezheng Peng^a,1, Yida Wang^a, Yannan Guo^a, Chenye Zeng^a, Rui Hua^a, Qingfei Liu^a, Xue Li^b, Ying Qiu^b, Zhao Wang^a,*

^a The Ministry of Education Key Laboratory of Protein Science, School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China

^b School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China

¹ Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Despite cisplatin has been widely used in the treatment of various cancers, the noteworthy nephrotoxicity greatly constrained its clinical value. For this reason, finding novel targeted therapies to attenuate the nephrotoxicity of cisplatin should be pretty significant. Our previous study found that histone deacetylase sirtuin 6 (SIRT6) could be an ideal target for the treatment of cisplatin-induced acute kidney injury. In this study, we explored the protective effects of ellagic acid, a natural polyphenol compound that activates SIRT6, on cisplatin-induced nephrotoxicity. Pre-treatment of ellagic acid attenuated cytotoxicity of cisplatin in primary renal cells and TCMK-1 cells. Moreover, ellagic acid ameliorated renal dysfunction, apoptosis and fibrosis induced by cisplatin in mice. Furthermore, ellagic acid reduced nephrotoxicity-associated inflammatory factor interleukin (IL)-1β and IL-6 expression both in vitro and in vivo. Mechanistically, ellagic acid reversed cisplatin-reduced SIRT6 expression and diminished cisplatin-induced tumor necrosis factor (TNF)-α expression. And SIRT6 knockdown abrogated the protective effects of ellagic acid on cisplatin-induced cell apoptosis, indicating the renal-protective effects of ellagic acid are mainly dependent on ellagic acid-mediated SIRT6 activation. Our results provide preclinical rationale for using ellagic acid as a feasible and promising agent to ameliorate cisplatin-induced acute kidney injury, and support ellagic acid as a potential adjunctive therapy for future cancer treatment.

Reference:

GAO Y Q, PENG K Z, WANG Y D, et al. Ellagic acid ameliorates cisplatin-induced acute kidney injury by regulating inflammation and SIRT6/TNF-α signaling[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2232-2241. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.043.