植物甾醇（PS）是一类天然存在的甾体类化合物，其结构与胆固醇相似，主要功能是降胆固醇、降心血管疾病、抗癌、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化的作用。PS在水中难以溶解的特性，肠道吸收率极低，也使得其在食品中的应用大大受限制。Zein是玉米中的主要储存蛋白，具有生物降解性、生物相容性、耐高温性及良好的成膜性，是一种普遍被认为安全的食品级蛋白质。利用玉米醇溶蛋白（Zein）为载体制备负载PS的纳米颗粒，以提高PS的水溶性、稳定性及生物活性具有重要意义。

云南农业大学食品科学技术学院的杨婷婷，任李顺，黄艾祥等采用反溶剂法制备了Zein负载PS纳米颗粒，对纳米粒包埋率、性质、微观结构进行评估，并考察了纳米粒的水溶解度、复溶特性、贮藏稳定性及胃肠道模拟消化，以期为提高Zein-PS纳米粒在胃肠消化吸收中的作用提供理论依据。

1.1.1 Zein与PS质量比纳米粒性能的影响

由图1可知，随着Zein添加量的增加，纳米颗粒的包埋率先增大后减小，当Zein与PS质量比为15∶1时，包埋率为83.42%。当质量比超过15∶1时，包埋率显著降低，可能是由于过量的Zein在溶液中易聚集，使纳米颗粒与反应溶剂之间的相互作用减弱。纳米颗粒的稳定性随着质量比的增加也是先增大而降低，说明随着Zein的增加，PS负载在颗粒表面和溶液中，而不是嵌入在蛋白基体中。PS不溶于水微溶于油，且界面张力随Zein的增加而减小，这归因于表面活性剂在油水界面的吸附。此外，油水界面张力的降低有利于更小粒度液滴的形成，与纳米液粒径变化保持一致。因此，选择Zein-PS质量比为15∶1。

从图2可见，随着水合时间延长，Zein和PS的结合程度增加，导致对PS包埋率显著升高且K值也升高，Zein和PS充分水合2 h后形成的纳米粒对PS的包埋率达到最大，为86.66%。且能够均匀分散在水中形成纳米分散体系，当水合时间继续延长，包埋率也缓慢降低，而离心稳定性持续增加。适当增加水合时间能有效提高包埋率及离心稳定性，但水合时间过多会使包埋率下降。这是因为在反应过程中，Zein和PS之间的界面张力增大，发生凝聚使稳定性降低。因此水合时间2 h时效果最佳。

1.1.4 超声时间对纳米颗粒性能的影响

如图4所示，随着超声时间的延长，纳米液的包埋率显著升高并且K值也随之升高，当超声时间超过20 min后，K值和包埋率均显著降低。增加超声时间能降低纳米液的粒径，从而提高离心稳定性及包埋率，但进一步增加并不能使包埋率及K值增加。这是由于在超声过程中，需要极强的剪切作用来克服Zein和PS分子间抗变形与分散的作用力。随着超声时间的延长，界面张力逐渐减小，使得剪切效果逐渐增强和液滴粒径增大，导致液滴之间发生碰撞及凝聚不稳定的现象。

1.2 Zein-PS纳米颗粒性能的正交试验

如表2所示，通过极差分析可知，以包埋率为考察指标，影响Zein-PS纳米粒性能的主次因素为：水合时间＞水合温度＞Zein与PS质量比，即水合时间对纳米颗粒的包埋率影响最大，Zein与PS质量比最小。在正交试验中得到的最佳工艺条件为A₂B₂C₂，由极差分析得到的最佳工艺为A₂B₂C₁。

方差分析见表3，由极差大小可知，B对纳米颗粒包埋率的影响更为显著，因此选取包埋率中B因素的较优水平为2 h。通过F值可知，各因素对纳米颗粒包埋率的影响顺序为：水合时间＞水合温度＞Zein与PS质量比。分别按正交试验A2B2C2和极差分析A2B2C1中得到的最佳工艺制备纳米颗粒，发现A2B2C2（86.65%）制备出的纳米粒包埋率比A2B2C1（80.24%）高。综合考虑得出最佳Zein-PS纳米粒工艺：Zein与PS质量比15∶1、水合时间2 h、水合温度55 ℃。

02 Zein-PS纳米粒的特性分析

2.1 粒径和Zeta电位分析

由图5A可知，纳米液的粒径随着质量比的增加而逐渐减小，这说明Zein的加入改变了PS的粒径分布情况。从图5B 可以看出，Zein纳米液的Zeta电位的绝对值比PS的更高，随质量比的增加，Zeta电位先升高后降低。这是归因于带带正电荷的Zein成功负载了PS，导致纳米液的负电荷增加。当Zeta电位低于－30 mV或高于30 mV时，该纳米液体系较为稳定。质量比15∶1的电位为（－22.79±0.015）mV，接近－30 mV，表明该纳米液体系趋于稳定状态。而且，Zein和PS之间存在较强的静电相互作用力，这有利于降低纳米液的粒径，从而提高Zeta电位和稳定性。此外，当质量比为15∶1时，纳米粒的PDI达到最大。质量比增大，PDI也显著降低，可能是由于Zein添加量越高，Zein和PS之间的相互作用力增强，从而降低界面张力，使纳米粒的粒径分布更均匀。所有粒径的PDI保持在0.3以下，说明Zein与PS结合形成更紧密的结构，导致粒径较窄且稳定性高，如图5C所示。

2.2 浊度和复溶稳定性

由图6可知，3 种样品在24 h后吸光度下降较快。在48～72 h之内Zein和PS的吸光度呈降低趋势，而Zein-PS的吸光度变化缓慢且基本保持不变，这说明Zein-PS冻干粉的复溶稳定性较好，Zein和PS最差，表明Zein成功的包封了PS，未出现沉降分层的现象。从表4可知，随着Zein与PS质量比的增加，其粒径和PDI呈先增大后降低的趋势，这与前面的稳定性和包埋率的结果相结合，说明纳米液的分散性较好。纳米粒冻干复溶后粒径变大，PDI也逐渐增大，说明冷冻干燥会使纳米粒聚集和分散性降低。复溶纳米液在室温下放置72 h后，质量比低于15∶1时，复溶纳米分散液是稳定的，而质量比超过15∶1时，发现复溶纳米液有明显的沉淀，说明过量的Zein不利于纳米粒的复溶。这可能是由于冷冻干燥会引起Zein和PS结晶度增加，从而使纳米复合物稳定性降低。

2.3 水溶解度

从图7可知，冻干粉的包埋率和水溶解度随着质量比的增加呈先增加后降低的趋势，当质量比15∶1时，包埋率和水溶解度最高，分别为75.67%和0.36 mg/mL。这与前面的包埋率和离心稳定性结果结合，说明质量比过高会使Zein和PS的结合度减弱，将导致包埋率、离心稳定性和水溶解度降低。这主要是由于蛋白与甾醇分子之间存在氢键和疏水相互作用，使Zein-PS纳米粒的溶解度和包埋率增大，但过多的质量比不利于其形成稳定结构。

03 Zein-PS纳米粒的结构表征分析

3.1 SEM观察Zein-PS纳米粒的形态

从图8A可知，Zein表面光滑呈近似球形的颗粒，而PS为杂乱的、无序的块状结构，如图8B所示，当Zein和PS结合后微观结构发生明显变化，纳米粒表面光滑且呈不规则的球形颗粒，如图8C所示，说明了PS成功包封在纳米粒中。与前面的包埋率和离心稳定性相结合，可能是由于PS填充了Zein内部的蛋白空间，并呈现在纳米颗粒的表面，使其离心稳定性和包埋率增加。由于Zein带正电荷，具有很强的静电吸引作用，使纳米粒的表面更加光滑和粒径分散更均匀，与粒径测得结果一致。Zein-PS纳米粒冻干后会发生聚集和吸附，是由于冻干过程中Zein中的含硫氨基酸形成了二硫键。这说明PS能够与Zein结合可以减少纳米粒的损失，增加纳米粒的稳定性，从而形成致密的网络结构。

3.2 FTIR分析Zein、PS之间的分子相互作用

从图9可知，Zein-PS纳米粒与Zein的红外光谱图相似，表明Zein和PS之间没有新的共价键生成。Zein和PS分别在3 413.92 cm^－1和3 447.63 cm^－1处的宽峰与—OH拉伸振动有关。随着Zein浓度的增加，—OH拉伸峰出现轻微的偏移，峰强度也增加。这些现象表明Zein和PS之间存在氢键作用。酰胺I带中Zein和PS的特征峰分别在1 658.99、1 658.51、1 627.71 cm^－1处，与C＝O伸缩振动有关。酰胺II带中Zein和PS的代表峰在1 523.51 cm^－1处与C—N和N—H拉伸振动有关，且PS在1 523.51 cm^－1处的特征峰几乎消失，这说明Zein中的酰胺基团和PS的羟基基团之间发生了静电相互作用。由于Zein-PS纳米复合物中存在氢键、静电相互作用，表明Zein和PS分子之间具有较好的相容性和稳定性。上述结果表明，PS与Zein结合后并未改变Zein的二级结构，而是加强了Zein和PS分子间的相互作用而形成纳米结构。因此，PS被成功地包埋在Zein壁材中。

04 Zein-PS纳米粒的稳定性分析

4.1 Zein-PS纳米粒在胃肠道模拟液中的释放

由图10可知，在胃液中，PS释放率为62.09%，而包埋后的Zein-PS纳米粒中PS释放率显著降低，为57.78%。这说明由PS和Zein通过静电作用和界面张力形成的纳米复合物，对Zein-PS纳米粒的包埋具有较好的缓释能力。在肠液中，PS和Zein的释放率均显著降低，但Zein-PS释放率下降高于PS。可能是由于PS在模拟肠液中极不稳定和结构易被破坏的原因，将Zein负载PS的纳米粒可以改善这一缺点。随着消化时间的延长，Zein-PS纳米粒在胃肠液中的释放率分别减少49.03%和28.11%，这说明胃蛋白酶和胰酶会导致以蛋白为壁材的基质发生水解并形成孔隙，从而延缓纳米粒释放率和提高其稳定性。

4.2 贮藏稳定性垃圾分类

表5为Zein-PS纳米粒粒径及包埋率在4 ℃和25 ℃分别贮藏30 d后的变化。不同温度下纳米粒的包埋率和粒径随贮藏时间延长均发生变化。随着时间的延长，不同温度下纳米粒的粒径均有所增加，但25 ℃时粒径上升速度比4 ℃快。4 ℃时纳米粒包埋率在贮藏30 d后变化较小，而25 ℃时纳米粒包埋率显著下降。这说明纳米粒在室温贮藏时粒径增加更快，在较高温度下易发生布朗运动，导致其产生聚结现象。因此，纳米液在高温或长时间储存时具有静电相互作用，导致纳米粒的构象发生变化，从而使其稳定性降低。由此可知，低温显示了纳米液具有较好的稳定性，表明复合体系稳定界面的能力更强。

结论

筛选了一种具有稳定性及缓释效果的纳米粒，通过正交试验确定Zein-PS纳米颗粒的最佳制备工艺：Zein与PS质量比为15∶1、水合时间2 h、水合温度55 ℃、超声时间20 min。所制备的纳米粒包埋率为84.97%，粒径为（479.76±0.38）nm，PDI为0.236±0.012，Zeta电位为（－22.79±0.015）mV。对于纳米粒的性质，添加Zein可显著提高其水溶解度和复溶特性。SEM显示纳米粒呈致密的网络形状及FTIR揭示其具有氢键、静电相互作用，并未改变Zein和PS的二级结构。Zein-PS纳米粒比PS更具有明显的缓释作用。在4 ℃贮藏过程中，可显著降低Zein-PS纳米粒的界面张力和形成粒径较小的纳米分散液，表现出更好的贮藏稳定性。说明Zein-PS纳米颗粒能有效改善PS的水溶性，增强其生物活性。因此，该研究结果可为Zein-PS复合纳米颗粒作为稳定剂或缓释剂提供新思路，并促进其在食品工业中的发展。

作者简介

通信作者：

黄艾祥，博士、二级教授、博士研究生导师，首批云岭产业技术领军人才。兼任中国奶业协会常务理事，云南省奶业协会会长、云南省现代农业奶牛产业技术体系乳品加工与质量安全岗位专家、云南省科技项目专家。主要从事食物资源（植物凝乳剂、益生菌）和特色畜产品（水牛乳﹑山羊乳、乳饼、乳扇及火腿、牛干巴等）的研发工作。主持国家自然科学基金、省级科研项目15项，以通讯作者在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》、《Journal of Dairy Science》、《Food Research International》、《食品科学》、《中国乳品工业》等国内外刊物发表论文100余篇，授 权国家发明专利10 项，获云南省科技进步二等奖2 项、三等奖1 项、云南省技术发明三等奖1 项。

本文《玉米醇溶蛋白负载植物甾醇纳米颗粒的制备及性能》来源于《食品科学》2023年44卷第18期40-48页，作者：杨婷婷, 任李顺, 陈光未, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220818-222。