副干酪乳杆菌（L. paracasei）和马克斯克鲁维酵母（K. marxianus）各自的生物学性质已被报道。然而，先前的研究不能提供在米酸中共同接种的两种菌株的相互作用及协同发酵的全面概况，也不能揭示在米酸风味形成和成熟过程中微生物生长和风味代谢调节之间的关系。因此，可通过转录组联合蛋白组定量分析来解释K. marxianus L1-1和L. paracasei H4-11协同发酵米酸的风味形成机理。课题组前期研究分析了L. paracasei H4-11和 K. marxianus L1-1在分子水平和蛋白水平上米酸风味机理，与mRNA相比，蛋白与代谢产物之间具有更直接的关联。贵州大学刘娜博士、贵州大学秦礼康教授和爱尔兰农业部Teagasc国家食品研究中心缪松教授在本研究中将继续通过转录组和蛋白组的联合分析，更加充分的解释米酸风味代谢物形成的原因，揭示L. paracasei H4-11和 K. marxianus L1-1协同发酵米酸风味强化机理。 在第3天和第1天分别进行了双菌发酵米酸和单菌发酵米酸的比较转录组和比较蛋白组分析，发现与L. paracasei H4-11生长有关的大多数DEPs定位在细胞质、细胞质膜和细胞壁中（图1A和图1C）。而与K. marxianus L1-1生长有关的大多数DEPs定位在细胞核、线粒体、细胞质和线粒体中（图1B和图1D）。表明这两种细胞具有不同的生活方式，并且对米酸的风味形成表现出不同的影响。
图1 双菌接种发酵米酸对比单菌接种发酵米酸第1和第3天时L. paracasei H4-11和K. marxianus L1-1差异表达蛋白质的亚细胞结构分布图 在K. marxianus L1-1存在时，L. paracasei H4-11中的上/下调DEPs富集表达在翻译、核糖体结构、与储存和加工联系的生物进程、与细胞过程和信号有关的细胞壁/膜/包膜生物发生、能量产生和转化、碳水化合物转运和代谢、氨基酸转运和代谢、核苷酸转运和代谢、无机离子转运和代谢、辅酶转运和代谢以及脂质与新陈代谢有关的运输和代谢通路中（图2A-B）。在L. paracasei H4-11存在时，K. marxianus L1-1中的DEPs在以上代谢途径中也富集表达（图S2C-D）。但两种培养物中DEPs表现出显著差异（P＜0.05）。蛋白组分析表明下调的蛋白可能与双菌发酵米酸对比单菌发酵米酸中不良风味特征相关的滋味物质（如苦味和涩味）信号强度的减少有关。综上，可进一步揭示这两种菌在发酵米酸中存在相互或协同作用。
图2 双菌接种发酵米酸对比单菌接种发酵米酸第1和第3天时， L. paracasei H4-11和K. marxianus L1-1差异表达蛋白的COG/KOG功能分类分布图 如图3，在双菌发酵米酸体系对比单菌发酵，L. paracasei H4-11在糖酵解过程中利用上调的磷酸葡萄糖突变酶（LSEI_0949）分解α-D-1磷酸葡萄糖为α-D-6磷酸葡萄糖，之后K. marxianus L1-1中的己糖激酶（KLMA_10051）发生下调使得生成的α-D-葡萄糖量减少，L. paracasei H4-11中的醛糖1-表异构酶下调，这反过来导致K. marxianus L1-1中的己糖激酶下调，底物减少后进而使得K. marxianus L1-1中的磷酸丙糖异构酶（KLMA_40125）、甘油醛3-磷酸脱氢酶、二磷酸甘油酯依赖性磷酸甘油酯变位酶以此呈下调变化，而上调的磷酸葡萄糖突变酶分解底物转化成更多的丙酮酸，使得L-乳酸脱氢酶活性（LSEI_0634）增强，从而形成更多的L-乳酸。同时，L. paracasei H4-11中的L-乳酸脱氢酶活性上调、D-乳酸脱氢酶活性下调，它们共同作用生成更多的L-乳酸。在丙酮酸代谢中，K. marxianus L1-1中的乙醇脱氢酶（KLMA_40220）分别表现出上调和下调变化，过多的丙酮酸被L. paracasei H4-11进一步分解，乙醇脱氢酶（LSEI_0775）活性表达为上调。而K. marxianus L1-1中上调的乙醇脱氢酶进一步使得乙醛脱氢酶（KLMA_40404）上调，乙醛脱氢酶可负责催化乙醛氧化为乙酸，促使乙酸含量增加。进而，L. paracasei H4-11在TCA循环中分解底物使得乙酸激酶的活性增强，进而生成更多的乙酸。而K. marxianus L1-1和L. paracasei H4-11中乙醇脱氢酶的共同上调促使更多的乙酸生成。导致K. marxianus L1-1中乙酰辅酶A、酰基辅酶A和N-乙酰转移酶表现为上调变化，而乙醇O-乙酰基转移酶呈下调。同时发现L. paracasei H4-11中乙酰辅酶A和N-乙酰转移酶呈上调和下调变化，这些酶促使乙醇和乙酸形成更多的乙酸乙酯。综上，在双菌培养体系中L. paracasei H4-11和K. marxianus L1-1协同作用促进了L-乳酸和乙酸乙酯的形成。
图3 双菌发酵米酸中L. paracasei H4-11和K. marxianus L1-1协同作用形成L-乳酸和乙酸乙酯机理 在米酸发酵第1天时，双菌发酵米酸对比单菌发酵米酸可知，L. paracasei H4-11中存在6个关键的上调基因及5个关键的上调蛋白和13个关键的下调蛋白质富集表达在丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、氮代谢、果糖和甘露糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、丙酮酸代谢和硫代谢KEGG通路中（表1）。此时，K. marxianus L1-1中存在6个关键的上调基因及13个关键的上调蛋白和15个关键的下调蛋白富集表达在丙酮酸代谢、ABC转运器、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等KEGG通路中（表2）。 表1 L. paracasei H4-11在第1天的差异表达基因/蛋白
表2 K. marxianus L1-1在第1天的差异表达基因/蛋白
在米酸发酵第3天时，双菌发酵米酸对比单菌发酵米酸可知，L. paracasei H4-11中存在2个关键上调基因及7关键下调基因，同时存在10个关键上调蛋白和8个关键下调蛋白富集表达在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氮代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、萘降解/氯烷和氯烯烃降解、ABC转运器、蛋白质输出等KEGG通路中（表3）。此时，K. marxianus L1-1中存在7个关键上调基因和2个关键下调基因和6个关键上调蛋白及23个关键下调蛋白富集表达在精氨酸生物合成、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氨酰基-tRNA的生物合成、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢KEGG通路中（表4）。 表3 L. paracasei H4-11在第3天的差异表达基因/蛋白
表4 K. marxianus L1-1在第3天的差异表达基因/蛋白
刘娜，贵州大学与爱尔兰农业部Teagasc国家食品研究中心联合培养博士，以第一作者身份发表SCI文章10篇，主要研究方向为食品微生物及发酵食品风味调控机理。 
秦礼康，贵州大学酿酒与食品工程学院副院长、教授、博士、博士生导师、学术学科带头人，兼任教育部食品科学与工程类专业教指委委员、省食安委委员、省法院知识产权审判咨询专家等。主要从事特色油料高品质制油及新产品延伸技术、优势杂粮杂豆主食化及高值化精深加工技术、特色发酵食品品质提升及新产品开发技术、营养健康全谷物主食化新产品加工及保质技术、食品安全控制及风险评估等科研工作。先后主持国家、省、市各类课题及企业横向项目30多项，经费1000多万元，发表学术论文50多篇(其中SCI收录20篇)，授权国家发明专利10件。 
缪松，教授，现为爱尔兰农业与食品发展部Teagasc国家食品研究中心终身高级研究员、爱尔兰国立科克大学（UCC）和都柏林大学（UCD）博士生导师，长期从事食品材料及贮藏加工技术领域基础理论和应用研究，曾在爱尔兰国家生物技术中心从事博士后研究，在荷兰联合利华研发中心任全球研发经理及研发专员。缪松博士自任职Teagasc国家食品研究中心以来，长期与国内多所高校及科研院所、跨国企业保持密切合作关系，主要研究方向为：食品物性材料学，食品干燥与造粒，粉末技术，益生菌和活性分子包埋，食品结构及传递体系设计，食品加工与功能性, 乳品技术以及植物基功能食品配料等。
Integrative proteomic-transcriptomic analysis revealed the lifestyles of Lactobacillus paracasei H4-11 and Kluyveromyces marxianus L1-1 under co-cultivation conditions
Na Liua,b,c, Likang Qina,*, Haiying Zenga, Anyan Wena, Song Miaoc,*
a School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China
b Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education), Collaborative Innovation Center for Mountain Ecology & Agro-Bioengineering (CICMEAB), College of Life Sciences/Institute of Agro-bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China
c Teagasc Food Research Centre, Moorepark, Fermoy, P61 C996 Co. Cork, Ireland
*Corresponding authors.
Abstract
Compared with the rice-acid soup inoculated with single starter, the synergistically intensified rice-acid soup inoculated with Lactobacillus paracasei H4-11 (L. paracasei H4-11) and Kluyveromyces marxianus L1-1 (K. marxianus L1-1) contained more flavor compounds. Organic acids mainly included L-lactic acid and the main volatile flavor component was ethyl acetate. Moreover, the signal intensity of astringency and bitterness and the total concentration of volatile sulfur compounds were reduced. The combined analysis results of RNA sequencing (RNA-seq) technology and 4D label-free quantitative (4D LFQ) proteomics explained the flavor formation pathways in rice-acid soup inoculated with L. paracasei H4-11 and K. marxianus L1-1. In L. paracasei H4-11, L-lactate dehydrogenase, phosphoglucomutase, acetate kinase, alcohol dehydrogenase and acetyl-CoA were up-regulated and D-lactate dehydrogenase and N-Acetyltransferase were down-regulated. In K. marxianus L1-1, Acetyl-CoA, acetaldehyde dehydrogenase, acyl-coenzyme A, N-acetyltransferase, and L-lactate dehydrogenase were up-regulated and hexokinase, alcohol dehydrogenase, and alcohol O-acetyltransferase were down-regulated. The above up-regulation and down-regulation synergistically promoted the formation of characteristic flavor compounds (mainly L-lactic acid and ethyl acetate). Enzyme-linked immunoassay (ELISA) and parallel reaction monitoring (PRM) quantitative analysis respectively verified that 5 key metabolic enzymes and 27 proteins in L. paracasei H4-11 and K. marxianus L1-1 were associated with the characteristic flavor of rice-acid soup, as confirmed by the quantitative results of 4D LFQ.
LIU N, QIN L K, ZENG H Y, et al. Integrative proteomic-transcriptomic analysis revealed the lifestyles of Lactobacillus paracasei H4-11 and Kluyveromyces marxianus L1-1 under co-cultivation conditions[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2195-2210. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.032.
