基于转录组和蛋白质组揭示多肽lunasin抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖

Introduction

随着基础和临床医学研究水平的进步，多种肿瘤病情的发展已能得到有效延缓和控制。然而，癌症仍是全球主要的致死因素之一。近年来，癌症及多种慢性疾病的发生率逐渐上升。大量研究证实，通过合理的膳食摄入可有效预防癌症和慢性代谢疾病的发生。

Lunasin最早是从大豆中分离获得的一种功能活性肽，含有44个氨基酸，具有多种生理活性。已经证实，lunasin可改善C57BL/6J小鼠高脂饮食引起的肥胖性炎症，调节机体免疫应答，并能预防免疫和炎症介导的人类胃肠道紊乱。此外，lunasin可抑制小鼠皮肤乳头状瘤的形成，诱导HT-29细胞G2/M周期阻滞和细胞凋亡，使半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性增加77%。

多肽的结构和氨基酸序列对其生物功能起决定性作用。Lunasin的生物活性可能是由Arg、Gly和Asp残基组成的RGD细胞粘附模块以及由位于lunasin羧基末端的9个天冬氨酸残基决定。例如，lunasin的聚天冬氨酸尾（poly-D）可与乳腺癌细胞中去乙酰化的组蛋白H3和H4结合，从而影响着丝粒复合体的形成，诱导癌细胞有丝分裂终止和细胞凋亡。然而，lunasin的抗癌机制仍缺乏系统研究。

转录组、蛋白质组等组学技术的发展极大地促进了癌症相关的科学研究。为全面了解lunasin的抗癌功能及其分子机制，中国农业科学院郝宇琼博士、杨修仕博士，上海市农业科学院郭慧敏博士等以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为模型，从转录水平和蛋白水平系统分析lunasin干预对MDA-MB-231的胞内调控作用，揭示lunasin抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制。

Results and Discussion

Lunasin抑制乳腺癌细胞增殖

以化学合成的lunasin多肽（纯度＞95%）为研究材料，细胞增殖实验显示lunasin对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用呈剂量-效应关系（图1），其半数抑制浓度IC50约为149 μmol/L。

图1 Lunasin抑制乳腺癌细胞的增殖

Lunasin通过抑制DNA复制阻断细胞有丝分裂，诱发线粒体介导的内源性细胞凋亡

转录组测序数据的层次聚类树状图、热图及火山图分析（图2）表明测序结果可靠，试验重复性较高，不同处理组间存在显著差异。通过对样本mRNA进行定量和差异表达分析，筛选差异表达基因进行富集分析（图3）。GO结果显示，生物调控、细胞复合物组织或生物发生、代谢过程、细胞增殖、信号传导等被显著富集；而KEGG结果表明，嘧啶代谢、细胞周期、DNA复制、P53信号传导等通路被显著富集。对差异表达基因进一步挖掘分析，发现lunasin处理组胞内促凋亡因子CYC1、APAF-1、BAK1、BAX基因以及CASP 3、7、9、14基因表达显著上调（图3C）。Lunasin干预导致BAX/BCL-2比例从22.9增加至210.6，可促使线粒体外膜通透性增加，导致线粒体膜间隙蛋白如细胞色素C释放并与Apaf-1相互作用，触发凋亡小体进行组装，最终导致caspase介导的细胞凋亡。实时荧光定量PCR分析（图4）进一步验证了转录组分析结果的可靠性。

图2 DA-MB-231细胞的转录组数据聚类分析

图3 MDA-MB-231细胞的转录组学分析

图4 关键基因实时荧光定量PCR验证

Lunasin通过溶酶体-线粒体轴诱发细胞凋亡

蛋白质组分析发现，溶酶体通路显著富集，与溶酶体相关的蛋白表达显著下调（图5），膜蛋白LAMP1、LAMP2、CD63及V-ATPase（ATP6V0A1）表达被抑制，多种蛋白水解酶合成受阻，包括DNASE2、SMPD1、LIPA、ASAH1以及Cathepsin组织蛋白酶家族（CTSS、CTSL、CTSD、CTSH）等。溶酶体膜上蛋白多达120余种，LAMP1和LAMP2是其中含量最为丰富的膜蛋白，可占溶酶体膜蛋白的80%，是维持溶酶体膜稳定性和完整性最主要的蛋白，作为溶酶体的标志物，其表达水平反映了溶酶体的功能状态。而溶酶体水解酶，尤其是Cathepsin家族常作为溶酶体功能的检测指标。Lunasin多肽可显著抑制溶酶体代谢通路，相关蛋白表达明显下调，使得溶酶体膜稳定性下降，通透性增强，也暗示了此时溶酶体的功能障碍。溶酶体膜通透性的增加是诱发细胞凋亡的重要因素。转录组分析已表明lunasin可通过诱发线粒体介导的内源性细胞凋亡来抑制癌细胞的增殖。而蛋白质组差异分析发现lunasin干预上调Bid、Apaf-1以及Caspase 3、4蛋白表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，进一步证实lunasin通过调控细胞凋亡来抑制MDA-MB-231细胞的增殖，而溶酶体可能与线粒体协同参与细胞凋亡。

图5 MDA-MB-231细胞的蛋白质组学分析

Conclusion

Lunasin多肽可显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖。基于独特的RGD细胞粘附基序和poly-D结构，lunasin可通过溶酶体-线粒体轴抑制DNA复制相关基因和蛋白的表达，并高度激活caspase介导的线粒体凋亡，诱导细胞凋亡，发挥抗癌功能。

第一作者

郝宇琼，女，博士，现为南方科技大学生命科学学院博士后，主要研究方向为以本生烟草为底盘的合成生物学体系开发。

郭慧敏，女，博士，现为上海市农业科学院生物技术研究所助理研究员，主要研究方向为杂粮功能因子活性评价与开发利用。

通信作者

杨修仕，男，博士，中国农业科学院麻类研究所助理研究员，中国作物学会藜麦专业委员会秘书长。主要研究方向为植物源功能因子评价利用。主持国家重点研发计划子课题、河北省重点研发计划课题等课题9项，参与国家重点研发计划项目、公益性行业（农业）科研专项、国家国际科技合作专项、对发展中国家科技援助项目等项目5项。发表论文57篇，第一或通讯作者SCI论文23篇。授权专利3项，制定行业标准2项，获科技成果3项，出版译著2本，登记品种2个。

Lunasin peptide promotes lysosome-mitochondrial mediated apoptosis and mitotic termination in MDA-MB-231 cells

Yuqiong Hao^a,b,1, Huimin Guo^c,1, Yechun Hong^b, Xin Fan^a,Yumei Su^d, Xiushi Yang^e,*, Guixing Ren^a

^a Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

^b Institute of Plant and Food Science, Department of Biology, Southern University of Science and Technology, Shenzhen 518055, China

^c Biotechnology Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China

^d College of Life Sciences, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830001, China

^e Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, China

¹ These authors have contributed equally to this work.

*Corresponding author.

E-mail address: yangxiushi@caas.cn

Abstract

Lunasin, a novel bioactive peptide, is well-known for its anti-proliferation activity. However, the mechanism of this effect is still poorly reported. Here, synthesized lunasin was used and its anti-proliferative function was observed at the concentration of 0.25 mg/mL in human breast cancer cell MDA-MB-231. Conjoint analysis of transcriptome and proteome of MDA-MB-231cells was further performed. The results demonstrated that cysteinyl aspartate specific proteinase (CASP) 3, CASP 7, and CASP 14 were significantly up-regulated after lunasin exposure, together with an increased Bax/Bcl-2 ratio from 22.9 to 210.6, which indicated that caspase-mediated mitochondria intrinsic apoptosis was highly activated. Moreover, lysosomal pathway was significantly suppressed under lunasin exposure, suggesting that lysosome may cooperate with mitochondria to participate in apoptosis. In addition, lunasin also down-regulated genes involved in DNA replication in MDA-MB-231 cells. Overall, our study reveals that the anti-proliferation effect of lunasin peptide might be triggered via the inhibition of DNA replication and cell mitosis, as well as the promotion of lysosome-mitochondrial mediated cell apoptosis.

Reference:

HAO Y Q, GUO H M, HONG Y C, et al. Lunasin peptide promotes lysosome-mitochondrial mediated apoptosis and mitotic termination in MDA-MB-231 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(6): 1598-1606. DOI:10.1016/j.fshw.2022.06.018.

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